CSFV E2蛋白主要抗原区域在马克斯克鲁维酵母中的表达及小鼠免疫

朱培霞，陈 蕾，段进坤，刘 洋，莫文娟，周峻岗，余 垚，吕 红

(1.复旦大学 生命科学学院 上海工业菌株工程技术研究中心，上海 200438； 2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的具有高度传染性和致死性的疾病，猪感染CSFV后主要表现为出血、弥散性的血管内凝血、白细胞减少[1].我国是养猪大国，占全球生猪养殖量的一半左右，猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失.CSFV是一种颗粒大小为34～50nm的囊膜病毒，表面有纤突结构，囊膜包裹着直径大小约29nm的核衣壳[2].核衣壳内含有单股正链的病毒RNA，其基因组大小为12.5kb，含两段5’端非编码区和3’端非编码区.CSFV基因组含一个开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，编码一种源蛋白，此源蛋白被宿主细胞和病毒自身的蛋白酶切割成12个成熟的病毒蛋白，分别是Npro、C、Ems、p7、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NA5A和NS5[3].其中C、Erns、E1和E2是CSFV的4个结构蛋白，Erns、E1和E2形成囊膜表面的纤突结构，其中E2蛋白是CSFV的主要保护性抗原蛋白，可以诱导宿主产生中和抗体，可以提供针对致死性CSFV攻击的保护[4-6].

CSFV只有一个血清型，但依据病毒基因组序列分为3个基因型(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)11个亚型(Ⅰ型： 1.1～1.4；Ⅱ型： 2.1～2.3；Ⅲ型： 3.1～3.4)[7-9].其中，1.1亚型代表株为经典的强毒株石门毒株，是我国用于生产灭活疫苗和攻毒的标准强毒株，目前中国系猪瘟兔化弱毒株均源于1.1亚型.中国猪瘟兔化弱毒疫苗性能好、安全、免疫效果好，是国际公认的安全有效的弱毒疫苗，对世界猪瘟的预防控制作出了重大贡献，但是唯一不足是不能用血清学方法进行免疫感染鉴别诊断，即不符合DIVA(Differentiation between Infected and Vaccinated Animals)要求.而亚单位疫苗不携带病毒遗传物质，具有安全性高，稳定性好的特点，更重要的是亚单位疫苗可以满足DIVA要求.欧盟自90年代后期就开始研制E2蛋白亚单位疫苗，目前拜耳(Bayer)公司和英特威(Intervet)公司利用杆状病毒表达系统开发的E2蛋白亚单位疫苗Bayovac CSF E2和Porcilis Pesti已经实现商业化[10].此外近年来2.1亚型CSFV已经成为我国CSFV的主要流行毒株[11-12]，但针对流行毒株的疫苗研究甚少.因此针对流行毒株的猪瘟亚单位疫苗是非常具有开发前景的新型疫苗.

目前关于E2蛋白表达量研究已有不少报道，如毕赤酵母高密度发酵后E2蛋白产量为15～30mg/L[13]，哺乳动物表达系统E2蛋白产量为40mg/L[14]，羊乳腺反应器中E2蛋白表达量为1.7g/L[15].马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)是一种食品安全级酵母，具有生长快、密度高、耐高温、可利用多种碳源等优点，是一种极具潜力的工业蛋白表达菌株[16-19].为了提高E2的表达量，本研究利用马克斯克鲁维酵母表达系统，分别研究了CSFV 2.1b型E2蛋白及其截短体mE2的重组表达，其中截短体mE2在马克斯克鲁维酵母中表达量达1.25～2.5g/L，纯化的mE2蛋白免疫小鼠后能够刺激产生特异性的血清IgG抗体，具有较好的免疫原性.

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒

马克斯克鲁维酵母表达菌株K.marxianusFim-1ura3Δ由本实验室保存，是URA3基因缺陷菌株.马克斯克鲁维酵母表达载体pUKD-N125是由本实验室构建保存[20]，包含马克斯克鲁维酵母KcURA3、马克斯克鲁维酵母自主复制序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子PINU序列以及菊粉酶终止子TINU序列.

1.2 表达外源蛋白的马克斯克鲁维重组菌株构建

将2013年湖南省送中国动物卫生与流行病学中心猪瘟阳性样品中分离的2.1b型HuN23/2013毒株[21]的E2基因序列，参照马克斯克鲁维酵母的密码子偏爱性进行E2基因的优化，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成.经E2蛋白序列比对与结构域分析，设计了E2基因截短体mE2(2070～2748bp)进行表达.E2基因扩增引物为E2-F(5’-TTTTTTTGTTAGATCCGCGGATGAGATTGTCTTGTAAG-GAAGACT-3’，下划线序列与pUKDN125载体序列一致，包含添加的ATG起始密码子)和E2-R(5’-AGCTTGCGGCCTTAACTAGTTTAACCGGCAGCCAATTGTTCGGTT-3’)；mE2基因扩增引物为E2-F和mE2-R(5’-AGCTTGCGGCCTTAACTAGTTTAGATACACTTACCGATTGGGTAA-3’)(下划线序列与pUKDN125载体序列一致，包含添加的TAA终止密码子).

以优化后合成的E2基因为模板，采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme Biotech)分别PCR扩增E2、mE2基因片段.扩增产物与限制性酶SpeⅠ和SacⅡ酶切的pUKDN125载体片段参照Gibson Assembly方法进行连接[22]，连接产物采用醋酸锂转化法转入马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ中[23]，然后在SD平板上(0.67%无氨基酸酵母氮源，2%葡萄糖，2%琼脂)筛选转化子.转化子分别用引物E2-F和E2-R、mE2-R进行PCR鉴定，PCR鉴定的阳性克隆分别命名为KM-CSFV-E2和KM-CSFV-mE2.

1.3 外源蛋白在马克斯克鲁维酵母表达的检测方法

1.3.1 抗原蛋白多克隆抗体制备

将不包含跨膜区域的E2蛋白编码序列克隆到pET-28a载体上，在大肠杆菌E.coliBL21菌株中重组表达.离心收集大肠杆菌重组表达菌株的菌体，破菌缓冲液重悬后，高压均质机(JN3000，广州聚能公司)破碎，抽提蛋白.包涵体蛋白经过尿素变性处理后进行镍柱纯化，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化蛋白浓度.

将20～60μg的纯化蛋白与5%～10%的弗氏佐剂混合制备抗原.选用6周龄健康雌性SPF级BALB/c小鼠，随机分组，每组各5只.每只小鼠注射剂量20～60μg抗原蛋白，免疫一次，21d后加强免疫.免疫后28d进行小鼠面颊取血，血样在37℃孵育1h后，3000r/min，4℃离心4min.吸取上层血清为E2蛋白鼠源多克隆抗体，保存于-20℃.将此鼠多抗作为Western blot检测的一抗，鉴定E2蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达.

1.3.2 外源蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达与鉴定

挑取外源蛋白马克斯克鲁维酵母重组菌株的克隆，接种于50mL的YD培养基中(2%酵母提取物，4%葡萄糖)，30℃培养72h.

72h后离心收集菌体，菌体用无菌水洗涤3次，破菌缓冲液重悬后，高压均质机(JN3000，广州聚能公司)破碎，收集细胞破碎液.细胞破碎液按1∶5的比例加入SDS-PAGE上样缓冲液(150mmol/L Tris-HCl,12% SDS,6%巯基乙醇,30%甘油,0.05%考马斯亮蓝G-250,pH 7.0)，沸水浴5min后冷却至室温，离心取上清进行SDS-PAGE和Western blot检测(一抗采用1.3.1方法制备的鼠多抗)，分析外源蛋白的表达情况.

1.4 马克斯克鲁维酵母重组菌高密度发酵和蛋白纯化

将鉴定为阳性菌株的马克斯克鲁维酵母重组菌接种于200mL YD培养基中，30℃，220r/min培养16h后按照1∶10比例接种于装有2L含葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁等成份的合成培养基中，在5L发酵罐中进行高密度发酵.发酵过程中通风并搅拌，以全料流加方式进行补料发酵，通气量3L/min，溶解氧(DO)控制在20%～30%，发酵温度30℃.发酵过程用流加氨水控制pH值5.5左右，每隔6h取样测定菌体密度，发酵周期为72h.

取40mL发酵液，离心收集菌体，然后用无菌水洗涤3次后重悬于200mL PBS缓冲液，高压均质机破碎4次，7000r/min离心10min取上清.重复离心一次以后，取4mL上清经冻干用0.5mL PBS缓冲液溶解，然后利用AKTA系统(AKTA PurifierTM100，GE healthcare公司)纯化mE2蛋白，分子筛凝胶层析柱为Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE healthcare)，上样后按样品峰收集洗脱液，并进行SDS-PAGE和Western blot检测，检测纯化效果.

1.5 抗原蛋白的免疫和免疫效果的检测

选用6周龄健康雌性SPF级BALB/c小鼠，随机分成2组，每组各5只.第一组为空白组，注射PBS不做免疫；第二组为免疫组，每只小鼠注射剂量20～80μg纯化后的CSFV mE2蛋白，免疫一次，21d后加强免疫.初次免疫后每7天进行小鼠面颊取血，血样在37℃孵育1h后，3000r/min，4℃离心4min.吸取上层血清，保存于-20℃.

采用的商用化猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前生物有限公司，批号160812)检测小鼠血清中的CSFV抗体.小鼠血清样品用PBS缓冲液稀释50倍，取100μL加入抗原包被板中，37℃孵育50min.TBST洗涤5次后，加100μL 1∶4000稀释的Abcam公司二抗Goat Anti-Mouse HRP(IgG H&L)(ab6789)，37℃孵育50min.TBST洗涤5次后，加入100μL TMB显色液(Tiangen)，室温避光显色10min.加入50μL 2mol/L硫酸终止液后，用Eon酶标仪(Biotek)检测450 nm的吸光值[24].

2 结 果

2.1 CSFV 1.1型与2.1b型中E2蛋白的序列差异性分析

目前临床用猪瘟疫苗的制备主要是用1.1亚型CSFV弱毒疫苗株，包括C株、LPC/AHRI和HCLV等.采用Vector NTI软件(Thermo Fisher Scientific)对3株1.1亚型CSFV毒株C(GenBank： Z46258.1)、HCLV(GenBank： AF531433.1)、LPC/AHRI(GenBank： AY526732.1)，与1株2.1b亚型CSFV毒株HuN23/2013(GenBank： KP233071.1)编码的E2蛋白进行序列差异性分析.

如图1所示，1.1亚型CSFV毒株和2.1b亚型CSFV毒株的E2蛋白的序列同源性约为88%，它们之间氨基酸序列差异主要集中在E2蛋白的抗原结构域(1～176aa).其中，E2蛋白的第16、21、24、36、40、45和49位氨基酸是与免疫反应相关的关键位点[25-26].除了第21位氨基酸以外，HuN23/2013株E2蛋白的其他6个位点与1.1亚型CSFV弱毒疫苗株都不一样.提示现有针对1.1亚型的猪瘟疫苗，可能不能很好保护宿主免于2.1b猪瘟病毒的感染.因此本文重点研究了CSFV 2.1b型HuN23/2013株的E2基因在马克斯克鲁维酵母中的重组表达.

2.2 CSFV E2蛋白及其截短体mE2的表达与鉴定

CSFV E2蛋白是一种囊膜糖蛋白，其中690～866aa为E2蛋白的主要抗原表位区(图2(a))，可分为A、B、C、D区[27].在空间结构上，A区和D区、B区和C区形成两个相对独立的结构单位[28].E2蛋白跨膜区位于Phe1031～Ile1053之间由22个氨基酸残基形成的疏水性区域，已报道的研究表明这段跨膜区会影响E2蛋白的重组表达[29-30].因此，除了进行全长E2蛋白的表达之外，本研究设计了E2蛋白截短体，命名为mE2，即去除了跨膜区且包含主要抗原区域，位于690～916aa的蛋白(图2(a)).我们全基因合成获得了E2基因，通过PCR扩增获得mE2基因，分别将2个基因片段克隆到马克斯克鲁维酵母重组表达载体pUKDN125中(图2(b))，转化到马克斯克鲁维酵母宿主菌Fim-1ura3Δ中，构建获得了2种马克斯克鲁维酵母工程菌株，分别命名为： KM-CSFV-E2和KM-CSFV-mE2.

图2 CSFV E2蛋白的结构与重组表达质粒图谱Fig.2 Schematic representation of CSFV polyprotein and recombinant expression plasmid map(a) CSFV E2蛋白的结构以及截短体mE2设计方案；(b) CSFV E2蛋白及截短体mE2重组表达质粒示意图

马克斯克鲁维酵母工程菌株分别用摇瓶发酵培养72h，发酵培养菌离心，用含4% SDS的PBS缓冲液(150mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,1.5mmol/L KH2PO4,8mmol/L Na2HPO4)重悬后破壁，抽提蛋白.用SDS-PAGE和Western blot的方法分析重组蛋白的表达(以PPV和PCV的衣壳蛋白作为E2蛋白表达鉴定检测的阴性对照，PPV和PCV的衣壳蛋白为本实验表达保存).

SDS-PAGE检测结果如图3(a)所示，E2蛋白的工程菌株发酵破壁液中，没有检测到明显的E2蛋白的表达，E2蛋白截短体mE2的工程菌株发酵破壁液中，在27kDa左右出现明显的蛋白条带，与mE2蛋白的理论分子量吻合(泳道4、5的29kDa、64kDa分别与PCV和PPV的衣壳蛋白的理论分子量吻合)，提示mE2可能在马克斯克鲁维酵母实现了重组表达(图3(a)).

用Western blot的方法鉴定马克斯克鲁维酵母重组表达的mE2，结果在27kDa左右处有明显的杂交条带，其大小与SDS-PAGE的位置一致，而PPV VP2蛋白与PCV2 cap蛋白泳道没有相对应的杂交条带，证明了截短体mE2在马克斯克鲁维酵母中获得了胞内表达(图3(b)).Western blot检测一抗为1.3.1方法获得的鼠多抗，二抗为Abcam公司的Goat Anti-Mouse HRP(IgG H&L)(ab6789).

此外我们用猪瘟抗体血清，再次进行了Western blot检测(二抗为Abcam公司的Goat Anti-Pig HRP(IgG H&L)(ab6915))，结果与鼠多抗杂交的条带一致，在27kDa左右处有明显的杂交条带，其大小与SDS-PAGE的位置一致，而PPV VP2蛋白与PCV2 cap蛋白泳道没有杂交条带(图3(c))，提示CSFV E2蛋白截短体mE2在马克斯克鲁维酵母中获得了胞内表达.同时也证明了制备的鼠多抗可以识别表达的mE2蛋白，并且具有特异性.

图3 CSFV E2蛋白及截短体mE2在马克斯克鲁维酵母中的表达Fig.3 Expression of the truncated and full-length E2 in K. marxianus(a) SDS-PAGE分析.M： 蛋白marker；1. Fim-1ura3Δ细胞裂解液；2. KM-CSFV-E2细胞裂解液；3. KM-CSFV-mE2细胞裂解液；4. KM-PCV-cap细胞裂解液；5. KM-PPV-VP2细胞裂解液.(b) Western blot分析(一抗为大肠杆菌表达的无跨膜区E2蛋白注射小鼠获得的鼠多抗).M. 蛋白marker；1. Fim-1ura3Δ细胞裂解液；2. KM-CSFV-E2细胞裂解液；3. KM-CSFV-mE2细胞裂解液；4. KM-PCV-cap细胞裂解液；5. KM-PPV-VP2细胞裂解液.(c)Western blot分析(一抗为猪瘟抗体血清).M. 蛋白marker；1. Fim-1ura3Δ细胞裂解液；2. KM-CSFV-E2细胞裂解液；3. KM-CSFV-mE2细胞裂解液；4. KM-PCV-cap细胞裂解液；5. KM-PPV-VP2细胞裂解液.

2.3 KM-CSFV-mE2重组菌高密度发酵与mE2蛋白的纯化

在5L发酵罐中进行了KM-CSFV-mE2重组菌的高密度发酵，如材料方法所介绍的方法，经过补料发酵72h后，KM-CSFV-mE2重组菌的细胞密度(OD600)达到520，细胞生物量(细胞干重)达到115g/L(图4(a))，按照BSA蛋白定量参比的方法，获得胞内表达的mE2蛋白的表达量约1.25～2.5g/L(图4(b)).

为了纯化mE2蛋白，我们收集了KM-CSFV-mE2高密度发酵后的细胞，加入含4% SDS的细胞裂解液，高压均质破碎离心，获得上清液.经浓缩后，用分子筛凝胶层析Superdex 200 Increase 10/300 GL进行纯化.取2mL含有mE2蛋白的细胞裂解液进样，高分段收集洗脱样品，分别用SDS-PAGE进行分析，发现在洗脱体积为8～20mL(约为柱体积的1/2)样品中有一大小约27kDa左右的蛋白(图4(c))，进一步用获得的鼠多抗进行Western blot鉴定，证明了该蛋白为纯化的mE2蛋白，其纯度达90%左右(图4(d,e)).

图4 KM-CSFV-mE2的高密度发酵与mE2蛋白的纯化Fig.4 High cell-density fermentation of KM-CSFV-mE2 and purification of CSFV mE2(a) KM-CSFV-mE2在5L发酵罐中的生长曲线；(b) mE2蛋白表达量检测.KM-CSFV-mE2细胞裂解液稀释10倍后，与不同浓度的BSA进行比较.M： 蛋白marker.(c)分子筛不同洗脱体积中mE2蛋白含量检测；(d，e) mE2蛋白纯化前后的SDS-PAGE和Western blot检测.Sup： KM-CSFV-mE2细胞裂解液上清; Purified： 8～20mL洗脱体积的样品.

2.4 CSFV mE2蛋白的免疫原性分析

用PBS缓冲液将纯化的mE2蛋白稀释至160μg/mL，按10%加入IMS1313水溶性纳米佐剂制备抗原，最终CSFV mE2浓度为144μg/mL.

按照1.5节介绍的方法，用该抗原注射免疫小鼠，选用PBS作为对照组，分别在注射后的14、21、28、35和42d采集血清，用商业化猪瘟ELISA检测试剂盒(用1.1亚型CSFV全病毒包被的微孔板)检测了小鼠产生的特异性IgG抗体水平.结果表明，与对照组相比，小鼠在注射了CSFV mE2蛋白28d后，产生了CSFV的血清IgG，并且随着时间的延长，IgG抗体水平(OD450)也在不断上升(图5).说明马克斯克鲁维酵母工程菌株来源的CSFV mE2抗原蛋白能刺激小鼠产生特异性抗CSFV IgG抗体.

图5 CSFV mE2疫苗免疫后小鼠血清中特异性IgG的抗体水平Fig.5 Level of E2-specific IgG in the serum of the mice immunized with the CSFV mE2 vaccine小鼠注射了PBS或CSFV mE2 抗原蛋白后，用ELISA检测血清中抗CSFV E2蛋白的IgG抗体水平.抗体水平用OD450的吸光值表示.柱状表示平均值±SD(n=5).

3 讨 论

近年来我国猪瘟病毒的流行病学调查发现2.1亚型CSFV已经成为我国CSFV的主要流行毒株，依据流行区域与流行时间，2.1型CSFV的10个亚亚型可分为3种亚基因型： 优势亚基因型(2.1b、2.1c、2.1h、2.1i和2.1j)、次亚基因型(2.1d和2.1g)和沉默亚基因型(2.1a、2.1e和2.1f)[31].显性亚基因型的2.1b型CSFV已经在多个国家流行，在我国也已经成为的主要流行CSFV毒株，广泛分布于广东、广西、四川和河南等21个省，但次要基因型和沉默亚基因的CSFV只发现于我国东南地区[31].2012—2014年由中国动物卫生与流行病学中心收集的来自16个省市的234份猪瘟阳性样品中，分离出157株2.1亚型CSFV毒株，其中129株被划分为2.1b亚亚型[32].2015—2016年研究表明CSFV亚型2.1分化出了很多亚亚型，但是2.1b型CSFV仍被认为我国流行毒株[31,33-34].此外，我国临床上猪瘟病毒疫苗都是使1.1亚型弱毒疫苗，与目前的流行的CSFV基因型并不一致，同时也不符合血清学DIVA，即区分猪血清的CSFV抗体是源于猪瘟病毒的自然感染还是接种的疫苗，可能导致出现持续感染的非典型性猪瘟的现象，给养猪业带来严重威胁[35].E2蛋白亚单位疫苗被称为E2蛋白亚单位DIVA疫苗，可以用检测抗Erns蛋白质的抗体的ELISA进行感染猪和接种猪的区分[1].因此，研发2.1b型CSFV E2亚单位疫苗的对我国猪瘟病毒的预防与控制具有重要意义.

E2蛋白存在6个潜在的N-糖基化修饰位点，分别位于Asn116、Asn121、Asn185、Asn229、Asn260和Asn297的天冬酰胺残基上，E2蛋白的N-糖基化影响CSFV的吸附、侵入、抗体的诱导以及宿主的免疫应答，但这些位点是否都存在糖基化修饰并不清楚[36].此外，研究表明E2糖蛋白的糖基化影响免疫原性和病毒对中和抗体的敏感性.E2糖蛋白的免疫原性受到特定糖基化位点的很大影响，关键的糖基化位点位于该蛋白的某些结构域内(即D/A结构域)[37].本研究以马克斯克鲁维酵母为CSFV E2蛋白的表达宿主，包含主要抗原区(即A、B、C、D区)的E2蛋白的截短体mE2蛋白获得表达，mE2截短体保留了E2蛋白的3个N-糖基化位点(Asn116、Asn121和Asn185).然而，酵母糖基化修饰与哺乳动物细胞的糖基化修饰存在很大差异，酵母高尔基体中常产生高甘露糖型糖链，缺少岩藻糖、半乳糖以及末端的唾液酸修饰[38].酵母高甘露糖型修饰的蛋白进入到动物体内由于可能与甘露糖受体结合，产生免疫反应、易被清除导致蛋白的半衰期短[39].迄今为止，酵母属中的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、毕赤酵母(Pichiapastoris)和白念珠菌(Candidaalbicans)的N-糖基化研究较为深入，它们的蛋白糖链修饰都是高甘露糖型[40].马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母同属酿酒酵母科，都存在过度糖基化修饰的现象[41].

本研究马克斯克鲁维酵母中胞内表达的mE2蛋白的大小与其预测的理论分子量相一致，进一步我们用去糖基化酶PNGFase对纯化后的mE2蛋白进行了处理，结果表明在马克斯克鲁维酵母中胞内表达的mE2蛋白并没有糖基化修饰(结果未显示).纯化后的mE2蛋白作为抗原免疫小鼠后，发现没有糖基化修饰的mE2能够诱导小鼠产生特异性的血清IgG抗体.据报道，大肠杆菌表达的无糖基化修饰的E2蛋白免疫兔或猪后，也能产生保护性抗体[42-43].但也有文献报道没有糖基化修饰的E2蛋白免疫猪后并没有产生中和抗体[37].此外还有研究表明E2蛋白的糖链修饰可以提高其免疫原性，体外糖基化修饰的E2蛋白免疫小鼠后，发现糖基化修饰E2蛋白产生的抗体水平显著高于没有糖基化的E2蛋白和CSFV病毒[44].因此，E2蛋白的糖基化是否是诱导中和性抗体和保护性免疫应答所必需的，还有待于进一步研究.