泡球蚴福尔马林固定标本的分子生物学鉴定方法*

王辰祎，刘巧凤，张亚楼，黄 燕，陈 凡，王 昕，Δ

1.成都医学院 研究生院(成都 610500)；2.成都医学院 基础医学院(成都 610500)；3.新疆医科大学 基础医学院(新疆830000)；4.四川省疾病预防控制中心 寄生虫病所(成都 610500)

多房包虫病又称为泡球蚴病，是一种严重的人畜共患疾病，是人体感染多房棘球绦虫的中绦期幼虫-泡球蚴或称多房棘球蚴所致的寄生虫病。幼虫寄生部位主要是肝，其他部位也可受罹。此病预后极差，应该引起人们高度重视。

福尔马林是一种防腐剂，对大多数生物标本的形态有着良好的保持作用，对维持组织细胞完整性方面优于其他固定液，故被广泛应用于生物标本的长期保存[1]。目前大多数医院及科研机构多用福尔马林来固定组织标本，其标本常用于医学病理学、医学检验和大病例回顾性研究等方面[2]。然而福尔马林的交联作用可导致标本提取的DNA质量下降,从而使PCR 扩增产物的生成及后续生物学分析变得困难[3]。因此，病理研究中采用福尔马林固定的包虫标本很难用于分子生物学研究，造成了福尔马林固定的包虫标本使用局限和浪费。一般来说，若要同时进行形态和分子生物研究，需要在保存阶段对同一标本进行福尔马林和乙醇两种固定液的同时保存，这在实际工作中过程较为繁琐。为解决这个问题，本研究对福尔马林浸泡标本进行分子生物学方面的应用探索，提取到了特异性泡球蚴DNA片段，并对该DNA片段进行了分子生物学分类鉴定。

1 材料与方法

1.1 虫体组织和固定液

两只Wistar大鼠体内腹腔接种传了17代的泡球蚴组织，收集其泡球蚴组织，并将其分别浸泡在10%甲醛溶液(福尔马林溶液)和100%酒精溶液中。第1只大鼠所提取的泡球蚴组织在两种溶液中浸泡时间为6个月，第2只大鼠的泡球蚴组织浸泡时间为12个月。从6个月福尔马林和酒精固定液中分别选取样本25例和8例，从12个月福尔马林和酒精固定液中分别选取样本18例和8例。

1.2 主要试剂、仪器

1.2.1 材料 石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，TIANamp FFPE DNAKit(离心柱型)，DP331(天根生化科技有限公司)；2000DNA Maker(Hunan innovagene biotechnology)；Goldview(西安赫特生物公司)；Proteinase K(Tritirachium album corporation)；GoTaq Green Master Mix M7123(Promega corporation)。

1.2.2 仪器 恒温金属浴，杭州博日科技有限公司，HB-202型；PCR扩增仪，Bio-Rad公司，T100型；离心机，Thermo公司，LEGENT MICRO 17型；chemiDoc化学发光凝胶成像检测仪，Bio-Rad公司，Universal HoodⅡ型；PowerPac电泳仪，Bio-Rad公司，Universal型；KD-BMⅡ电脑生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；石蜡切片机，徕卡显微系统上海有限公司，RM2235cwEU型；显微图像采集系统，Nikon公司，ECLIPSE 55imicroscop。

1.3 方法

1.3.1 泡球蚴组织的制备 麻醉处死感染泡球蚴10个月的1只雌性Wistar大鼠(第17次传代)，75%乙醇溶液浸泡15 min。无菌条件下开腹，收集腹腔中泡球蚴囊泡组织若干[4]，分别浸泡置10%甲醛溶液和100%酒精溶液中6个月。相同的方法，收集另1只感染泡球蚴10个月的雌性Wistar大鼠(第17次传代)腹腔中的泡球蚴组织，分别浸泡在以上两种溶液中12个月。取上述方法所固定的福尔马林泡球蚴标本，经过脱水、透明、浸蜡、包埋，制备成石蜡组织块，切片后，HE染色，进行形态学观察。

1.3.2 泡球蚴固定标本DNA的提取 福尔马林固定液中取出不同的泡球蚴囊泡组织，用剪刀剪碎，从中取约30 mg样本，置于2 mL离心管中。以同样方法，从酒精固定液中取出泡球蚴组织样本作为阳性对照，并以老鼠新鲜肝组织的提取物作为阴性对照。加入现配的PBS缓冲液1 500 mL，漩涡震荡10 s，10 000 r/min(9 600×g)，离心半径8.6 cm，离心2 min，弃去上清(不要吸出任何沉淀)，重复3次。每管加入200 mL GA溶液和20 μL蛋白酶K(均由TIANamp FFPE DNA Kit提供)，充分漩涡震荡混匀10 s，置于恒温金属浴中，56 ℃孵育数小时或过夜，直至观察到样本完全裂解，消化液中无组织残渣为宜[5]。再置于恒温金属浴中，90 ℃孵育1 h，之后步骤按照试剂盒说明书操作。

1.3.3 DNA扩增，基因序列分析及虫种鉴定 将提取的 DNA 基因组，扩增多房棘球绦虫的线粒体 12S rRNA 特异目的 DNA 片段, 进行 PCR鉴定。反应总体积为 25 μL ，其中包含12 μL Go Taq Green Master Mix，9 μL无菌去离子水，2 μL DNA样本，用于检测多房棘球绦虫的上游引物EmH15:5'-CCATATTACAACAATATTCCTATC-3'和下游引物EmH17:5'-GTGAGTGATTCTTG TTAGGGGAAG-3'各1 μL，目标片段大小为200 bp。热循环参数为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40次循环，最后72 ℃延伸10 min[6-7]。对PCR产物纯化回收后进行核酸序列测定 (成都擎科生物工程技术服务有限公司)，所得结果在 GenBank 数据库中 (http:/ /www. Ncbi.nlm. nih. gov)BLAST程序进行同源性比较及虫种遗传分类分析。

2 结果

2.1 形态学观察

多房棘球绦虫的幼虫称泡球蚴，由无数圆形或椭圆形大小囊泡相互聚集而成，为淡黄色或白色的囊泡状团块，囊泡外壁为角皮层，整个泡球蚴与周围组织间无纤维组织被膜分隔。泡球蚴多以外生性出芽生殖不断产生新囊泡，长入组织，少数也可向内芽生形成隔膜而分离出新囊泡[8]。经过肉眼观察，腹腔接种泡球蚴的Wistar大鼠10个月后体内器官几乎全部被大小囊泡占据(图1)。在Wistar大鼠体内泡球蚴结构为无数透明、半透明或白色囊泡，囊泡直径大小不等，小的为1～3 mm，大的为1 cm以上，厚度0.4～1 cm。在呈葡萄状的囊泡群中也可出现不典型的孤立囊泡结构(图2A～2B)。一些囊泡内含较多囊液和原头蚴(图2C)，也有一些囊泡质地较硬，含大量干酪样物而无透明囊液(图2D)。把实验标本制备成石蜡组织块，切片后HE染色，镜下观察可见，泡球蚴角皮层呈薄而无细胞结构的条带状，有细胞结构的生发层附着在角皮层上，囊内含有原头蚴，原头蚴中可见顶突和吸盘，还有数个成排排列的小钩结构，在活跃的泡球蚴中，还可以看到丰富的生发层和钙颗粒(图3A)。不活跃的虫体组织中，含有少量的细胞和生发层，也没有原头蚴结构(图3B)。不同部位取样后，分别在显微镜下观察泡球蚴的角皮层、生发层及原头蚴的形态结构。

图1 多房棘球蚴在腹腔接种传了17代的Wistar大鼠

图2 大鼠体内泡球蚴

注：A：囊泡聚集的典型葡萄状组织肉眼观；B：孤立的单个囊泡肉眼观；C：含有丰富囊液的组织；D：干酪样的硬结样囊泡

图3 泡球蚴病理切片

注：A：高倍镜下泡球蚴结构，虫体很活跃，可见丰富的生发层、原头蚴组织和蓝色钙颗粒；B：泡球蚴组织，其虫体不活跃，细胞少，生发层少，无原头蚴组织

2.2 多房棘球绦虫EmH15/17基因的扩增及鉴定

泡球蚴线粒体基因的PCR扩增结果电泳图(图4)。引物扩增效果良好，在预期的200 bp位置出现特异性的扩增条带，无非特异条带出现。结果与GenBank中编号为AB031351多房棘球绦虫基因具有完全一致的同源性(图5)。实验表明，在福尔马林25例浸泡6个月和18例浸泡12个月的泡球蚴标本中，均可扩增出特异性条带，其阳性率为100%，且用酒精作为阳性对照时，同样条件下扩增后，阳性率也为100%，电泳显示条带亮度无明显差异。以鼠肝脏组织作为DNA模板未能扩增出特异性条带。

图4 EmH15/17基因的扩增

注：M：DNAmarker；1：在福尔马林固定液中浸泡6个月的泡球蚴组织；2：在酒精固定溶液中浸泡6个月的泡球蚴组织；3：在福尔马林固定液中浸泡12个月的泡球蚴组织；4：在酒精固定溶液中浸泡12个月的泡球蚴组织；5：新鲜的老鼠肝组织，阴性对照；6：没有加入DNA样本的阴性对照

图5 GenBank中编号为AB031351的多房棘球绦虫基因序列

3 讨论

随着分子生物学的不断发展，近年来有关包虫分子生物鉴定的报道很多。本研究首次针对福尔马林固定液中的鼠来源的泡球蚴组织为DNA模板，克服了其提取和鉴定过程中的困难。从多次实验研究来看，泡球蚴福尔马林固定标本进行虫种鉴定有以下特点。

3.1 福尔马林固定液的浸泡时间

虽然福尔马林对保持生物标本的形态和组织细胞完整性等方面优于其他固定液，但可导致DNA链脆性增加，使DNA之间交联后形成复合物。Legrand等[9]对福尔马林溶液浸泡组织标本的影响研究表明, 固定16 d 可成功获取250 bp 左右的DNA片段, 固定32 d则只能获取100 bp 左右的DNA片段[10]。本研究采用福尔马林溶液浸泡6个月和12个月的泡球蚴组织标本，按所述提取方法，仍取得了很好结果。

3.2 泡球蚴组织的选取

经过观察，即使啮齿类动物大鼠为多房棘球绦虫的适宜宿主，其体内生长形态仍有差异，可观察到典型的呈葡萄状囊泡群，也可呈单个囊泡状，可观察到含有囊液和原头蚴的组织，也有干酪样而无原头蚴的硬结样囊泡，仅通过形态学特性进行鉴别有一定的难度。实验结果表明，不用经特殊挑选和处理，这些形态结构不同的样本均可经DNA提取扩增出目的条带。

3.3 DNA的提取过程

在DNA提取的消化过程中，试剂盒说明书要求将组织样本在56 ℃孵育1 h，但结果显示，1 h不能将组织样本消化完全，会影响后续的离心柱提取操作，实验表明，适当延长消化时间对于DNA提取是有好处的[11]，当肉眼观察到离心管中样本完全裂解，呈无组织残渣的无色或淡黄色澄清液为宜。含有大量囊液的组织样本易消化，一般加入前述试剂盒中的20 mg，20 μL/mg的蛋白酶K消化6～8 h即可使组织消化完全，而干酪样的硬结样囊泡不易剪碎，且需更长消化时间。对于难以消化的组织，可采用自购的蛋白酶K将浓度调至30 μL/mg，缩短消化时间，直至样本完全裂解。

本研究尝试用传统的蛋白酶K消化酚氯仿抽提法和蛋白酶K消化氯化钠盐析法对标本进行提取，只能提出部分样本DNA，其凝胶电泳成像检出率结果远不如前述的方法，可能与样本组织来源不同有关。在研究福尔马林固定的泡球蚴标本时，本研究选取试剂盒离心柱型的方法。

3.4 PCR的扩增

在本研究的前期实验中也使用了传统的多房棘球绦虫线粒体扩增引物COX1和NAD1[12-13]。COX1(mtDNA)上游引物为5'-AGAGAAAAT TGTGGAGTTACTGCT-3'，下游引物为5'-ATTA CTAATCAACTTAGACTTACA-3'(目的片段为1 793bp)；NAD1 (mtDNA)上游引物为5'-TAG TTTAATTAGAATGTCGGTTTG-3'，下游引物为5'-TCTTGAAGTTAACAGC ATCACGA-3'(目的片段1 013 bp)，扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环，72 ℃延伸7 min。结果表明，同一种固定液中浸泡6个月和12个月的样本阳性率无明显差别，福尔马林固定液中有25%样本被扩增出目的条带，酒精固定液中43%的样本能够被扩增。为了提高实验的阳性率和引物的灵敏性，考虑运用巢式PCR，分别以COX1和NAD1为内引物，在Primer 5中设计了两对外引物。第1对外引物COX1(mtDNA)：上游引物5'-AGTGGTGTAGTTC TTATGAGTG-3'和下游引物5'-ACCTAAACA ACCAACTTCACA-3'(目的片段为2 090 bp)；NAD1(mtDNA)：上游引物5'-AATTGGGT TGAGTAGGTGTT-3'和下游引物AAAGTAAGC ATAACCGACCAT-3'(目的片段为1 226 bp)，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸7 min，进行巢式扩增后，电泳结果显示大量样本出现涂抹状条带，26%的福尔马林固定样本可见特异性条带，在酒精样本中，阳性率约为47%。第2对外引物COX1(mtDNA)：上游引物5'-AGGGCTG CATGGCAGGTTACT-3'和下游引物5'-CCGTTA AGCATGATGCAAAAGGCAA-3'(目的片段为2 351 bp)；NAD1 (mtDNA)：上游引物5'-TCGTC TGTTGCTACATTGGTTGT-3'和下游引物5'-ACCTGCCATGCAGCCCTATT-3'(目的片段为1 639 bp)，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，65 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸7 min，进行巢式扩增后，电泳结果显示仍见涂抹状条带，两种固定液中阳性率均约为10%。尝试逐渐提高退火温度或降低循环次数等方法，结果由涂抹状条带逐渐变淡直至无任何扩增条带的出现。实验过程中也使用了另一种多房棘球绦虫的扩增引物ND1(目的片段分别为731 bp和631 bp)[14]，电泳结果表明福尔马林固定液中泡球蚴样本在目的条带731 bp和631 bp的阳性率分别为14%和26%。

在本研究中，多房棘球绦虫的特异性引物EmH15/17基因的扩增得到了100%阳性率，分析以上扩增结果，不能把原因全部归结于福尔马林对DNA的破坏，因为在酒精固定液中，仍有大量样本不能被扩增出来。也可以排除DNA提取量不足的原因，推测可能因为目的片段较大，使得样本DNA不能被扩增，因此最终选取EmH15/17作为扩增引物。这种分子生物学的鉴定方法，可用于病理学科中包虫福尔马林固定标本，进行虫种鉴定和回顾性研究。该方法能从福尔马林固定的泡球蚴标本中，提取到特异性的DNA片段，对于分子生物学分类鉴定工作十分理想。在后续研究中，会尝试用上面的方法对临床中福尔马林溶液甚至是石蜡固定的人体标本进行鉴定和研究。这种泡球蚴福尔马林固定标本的分子生物学鉴定方法在今后临床诊断中具有一定价值和广泛应用前景。