活血通腑方对大鼠术后腹腔粘连巨噬细胞细胞因子的影响

王雅洁 李文林 连紫宇 马妍婷 赵敏 杨丽丽 唐升进 王叶同 曾莉,

(南京中医药大学 1第二临床医学院，江苏 南京 210046；2图书馆；3第一临床医学院；4护理学院)

腹腔粘连是腹部外伤或手术后在壁层腹膜与脏层腹膜及脏层腹膜之间形成的异常粘连〔1〕。有研究报道，90%以上的开腹手术会发生腹腔粘连〔2〕，腹腔粘连形成后可引起诸多并发症，如慢性腹痛、不孕症、肠梗阻等〔3,4〕，不仅给患者带来极大的痛苦，并且增加社会负担〔5〕。中医认为术后腹部气血瘀滞与腹腔粘连的形成关系密切〔6〕。经优化的活血通腑方，具有通里攻下、泻下通腑、活血化瘀、行气逐瘀之能。活血通腑方治疗肠粘连及粘连性肠梗阻疗效显著〔7,8〕。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在疾病的发生发展中起重要作用，具有灭菌、吞噬病原体和分泌细胞因子等功能，同时维持体内平衡〔9〕。当受到不同因子刺激时，巨噬细胞会形成经典活化(M1)型和替代活化(M2)型巨噬细胞。受炎性微环境促炎因子刺激，巨噬细胞向M1型转化，其分泌的细胞因子白细胞介素(IL)-1、IL-6等能够促进炎症反应，清除微生物，形成促炎症反馈；被抗炎性细胞因子刺激，则转化为M2型，M2型巨噬细胞分泌的IL-4、IL-13等可以降低炎症反应，形成抗炎症反应的正反馈机制〔10〕。因此通过调控巨噬细胞极化，调整免疫微环境是防治腹腔粘连的重要途径，本实验旨在探索活血通腑方对巨噬细胞极化表型细胞因子表达的调控作用，探究活血通腑方防治术后腹腔粘连的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性SD大鼠50只，体重(250±20)g，由上海市实验动物中心提供，合格证号2010002609303。动物于实验前适应性喂养，自由饮食，照明昼夜交替。

1.2仪器和试剂 活血通腑方由大黄10 g、桃仁10 g、延胡索10 g、莱菔子10 g、红花6 g和芒硝10 g组成，均购自江西济世堂药业有限公司(生产批号：170106020)；四磨汤口服液购自湖南汉森制药股份有限公司(生产批号：1607206)；氟伐他汀胶囊购自北京诺华制药有限公司(产品批号：X1497)；生理盐水购自山东华鲁制药有限公司(产品批号：C15082702)。酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自南京金益柏生物科技有限公司，台式高速冷冻离心机(型号：Allegra 64R)购自美国Beckman公司，酶标仪(型号：Victor X3)购自美国PerkinElmer公司。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪购自美国ABI StepOne Plus。TRIzol Reagent(产品批号：15596026)、逆转录试剂盒(产品批号：K1622)购自赛默飞世尔科技有限公司，Taq酶试剂盒(产品批号：Q341-02)购自诺唯赞生物科技有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3药物制备 取大黄50 g、桃仁50 g、延胡索50 g、莱菔子50 g，加饮片总量15倍(3 000 ml)的70% 乙醇，回流提取2 h，分2次进行，药液滤过，合并两次提取液，滤液经旋转蒸发回收乙醇，浓缩至无醇味。上述药渣与红花30 g合并，加饮片总量20倍水煎煮，分3次煎煮，每次煎煮1 h，药液滤过后合并，滤液旋转蒸发浓缩至相对密度为1.00～1.10(60℃)，药液冷却后，进行醇沉，加乙醇至含醇量50%，搅匀后静置48 h，取上清液加入芒硝50 g，药液旋转蒸发浓缩至相对密度1.00～1.10(60℃)，4℃冷藏备用〔11〕。

1.4方法

1.4.1造模方法 使用锉刀法建立大鼠术后腹腔粘连模型。造模前，全部大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，修剪腹部皮毛，仰卧位固定于鼠板，碘伏溶液消毒后，酒精脱碘，无菌操作下前正中开口，轻轻将盲肠拉出腹腔，在盲肠端用什锦锉刀反复摩擦5 min，摩擦至表面出现针尖状出血点，将盲肠纳入腹腔，恢复原状，逐层缝合肌肉层和表皮，75%酒精消毒。假手术组大鼠，腹部开口后，空气中充分暴露5 min，逐层缝合伤口，酒精消毒〔8〕。

1.4.2分组及给药 将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、四磨汤组、氟伐他汀组和活血通腑方组，每组10只。假手术组大鼠，腹部开口后，空气中暴露5 min，不予造模，逐层缝合伤口。模型组、四磨汤组、氟伐他汀组和活血通腑方组常规造模，术后第2天开始灌胃给药，灌胃药液预热，温度37℃左右。四磨汤组给予四磨汤口服液，0.54 ml/100 g灌胃，1次/d，连续7 d；氟伐他汀组给予氟伐他汀胶囊生理盐水，2 mg/kg，0.4 ml/100 g灌胃，1次/d，连续7 d；活血通腑方组给予活血通腑方水煎液，按大鼠体重1.044 g/100 g计算(等效量)，1 ml/100 g用药量灌胃，1次/d，连续给药7 d。模型组和假手术组均用生理盐水灌胃，1 ml/100 g，连续7 d。

1.5观察指标

1.5.1粘连评分 观察造模后动物的一般情况及切口愈合状况，术后第8天剑突下“U”形切口进腹，采取血液和粘连组织，根据Phillips分级标准〔12〕观察组织粘连情况。0级：无粘连，计0分；Ⅰ级：少量粘连，粘连面积<20%，疏松易分，计1分；Ⅱ级：中度粘连，粘连面积<40%且≥20%，计2分；Ⅲ级：粘连广泛，粘连面积在40%～60%，分离后局部有损伤和渗血，计3分；Ⅳ级：粘连成团，粘连面积>60%，分离困难，引起肠梗阻，计4分。

1.5.2Masson染色 取大鼠肠创面处粘连组织，放入10%甲醛溶液固定，组织脱水后，进行石蜡包埋，切片；切片脱蜡至蒸馏水；用weiger铁苏木精液染核10 min；盐酸乙醇分化；用Masson复合染液染5～10 min；使用蒸馏水冲洗；磷钼酸浸泡5 min后甩干；苯胺蓝浸泡10 min，蒸馏水稍冲洗；分化液分化2次，每次30 s；使用蒸馏水冲洗2 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后树脂封片，镜下观察病理改变。

1.5.3酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 取实验动物血液，全血室温静置1 h，-4℃过夜，离心机3 000 r/min，20 min，提取血清，按照试剂盒说明书步骤对IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-4、IL-10、IL-13细胞因子进行检测。

1.5.4RT-PCR检测IL-6、TNF-α、精氨酸酶(Arg)-1 mRNA表达水平 按照PCR RNA提取实验步骤，提取粘连组织RNA，按照PCR试剂盒说明书步骤逆转录cDNA。引物序列：IL-6：正向5′-CCACTGCCTTCCCTACTTCA-3′，反向5′-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3′；TNF-α：正向5′-GCCAATGGCATGGATCTCAA-3′，反向5′-CCCTTGAAGAGAACCTGGGA-3′；Arg-1：正向5′-ACCCTGACCTATGCGTCATT-3′；反向5′-ATTCCCAGAGCTGGTTGTCA-3′；GAPDH：正向5′-GCTACACTGAGGACCAGGTT-3′，反向5′-CCCAGCATCAAAGGTGGAAG-3′。

1.6统计分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析、秩和检验。

2 结 果

2.1一般情况 整个实验中，各组均无死亡。术后24 h各组一般状态较差，活动少；术后48 h各组状态尚可，活动量较前有所增加；术后72 h各组状态正常，活动、饮食正常。术后切口愈合良好，无红肿感染。

2.2Phillips分级结果 假手术组7只腹腔未见粘连形成，3只见少量粘连，疏松易分；模型组均见大片粘连，难以分离；四磨汤组、氟伐他汀组及活血通腑方组均有不同程度粘连；与模型组相比，四磨汤组、氟伐他汀组及活血通腑方组的粘连评分均有不同程度的减轻(P<0.05，P<0.01)，其中活血通腑方组和四靡汤组粘连评分降低显著(P<0.01)。见表1。

表1 各组术后7 d Phillips分级(n=10，n)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；下表同

2.3粘连组织Masson染色结果 粘连组织镜下呈蓝色的为胶原纤维，呈红色的为肌纤维。假手术组局部可见少量浅蓝色；模型组则呈现为大片密集的深蓝色，提示组织存在大量胶原纤维，粘连明显；四磨汤组、氟伐他汀组及活血通腑方组呈现较模型组少而稀疏的浅蓝色，提示胶原纤维增生较模型组减少，见图1。

图1 各组粘连组织Masson染色观察(×200)

2.4ELISA检测结果 与假手术组相比，模型组血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量显著增多，IL-4、IL-10、IL-13含量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，活血通腑方组、四磨汤组、氟伐他汀组IL-1、IL-6、TNF-α表达显著降低(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13表达显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组IL-1、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13及TNF-α表达量

2.5RT-PCR检测结果 与假手术组比较，模型组IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表达量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，活血通腑方组、四磨汤组、氟伐他汀组IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表达量显著降低(P<0.01)，见表3。

表3 各组IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表达量

3 讨 论

研究表明活血化瘀药具有促进肠管蠕动，防止组织缺血，改善腹腔血液循环，抑制结缔组织增生等西药所无法替代的作用〔13，14〕。活血通腑方主要治疗瘀血症，特别是腹部术后瘀血症，多用于防治术后粘连性肠梗阻，对处方进行优化〔15～17〕,形成现在的活血通腑方，其中大黄、桃仁为主药皆入大肠经，通里攻下，泻下通腑、活血化瘀；芒硝入胃、大肠经，泻下润燥软坚；莱菔子归脾、胃经，降气除胀；合用理气活血药红花、延胡索等增强行气逐瘀之能。研究发现，活血通腑方能够治疗术后粘连性肠梗阻〔7〕，抑制腹腔粘连〔18，19〕，其含药血清可降低CD40、CD40L表达，抑制单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶(MMP)-9与转化生长因子(TGF)-β的mRNA表达水平，抑制炎症反应，减少纤维蛋白的沉积和粘连带的形成，降低粘连的发生〔8〕。

炎症细胞的特异性炎症反应贯穿于整个粘连形成过程。在粘连形成过程中，巨噬细胞的自分泌和旁分泌作用会加重腹腔微环境的恶化，从而促进粘连形成〔20〕。受腹腔微环境影响，巨噬细胞可以被诱导分化成不同功能的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可分泌多种炎症因子和趋化因子，例如IL-6、TNF-α等，这些细胞因子可清除微生物，促进炎症反应〔21,22〕，导致机体正常组织的炎症损伤〔23〕，M2型巨噬细胞分泌的IL-4、IL-13等细胞因子则具有相反的功能，可通过抗炎细胞和抗炎因子抑制促炎细胞和促炎因子，降低炎症反应，促进组织修复〔24〕。

本研究提示活血通腑方治疗后，由M1型巨噬细胞分泌出的促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α含量的降低，由M2型巨噬细胞分泌的抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13的升高，提示可以通过巨噬细胞入手来防治术后腹腔粘连。

本研究发现活血通腑方能够防治大鼠术后腹腔粘连，与术后腹腔粘连部位的巨噬细胞关系密切，活血通腑方可以通过重塑腹腔微环境，调控腹腔巨噬细胞，诱导巨噬细胞向不同表型极化；因此，通过诱导巨噬细胞极化来观察巨噬细胞影响术后腹腔粘连的作用机制将成为下一步研究的主要目的。