王媛媛 吴旭萍 林胜友*
放射性肺损伤主要包括放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶段。肌成纤维细胞在放射性肺纤维化过程中起重要作用,上皮间质转化(EMT)过程为组织纤维形成过程中的中介过程[1-2]。其特征在于上皮蛋白如E-钙粘蛋白(E-cadherin)和蛋白质的缺失,从而获得新的间质标志物,包括波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),而下调E-钙粘蛋白表达可通过转录实现抑制,包括snail蛋白[3]。ERK/GSK3β/snail通路是新近发现的放射性肺纤维化相关EMT的重要信号调控通路[4],而GSK3β/snail复合体能被上游磷酸化的ERK解离,snail被释放,恢复活性。沉默大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞ERK基因,能够减弱GSK3β复合物的解离,从而减少有活性的snail,调控EMT过程。本文探讨EMT过程中加味麻杏石甘汤对ERK/GSK3β/snail信号通路的调控作用。
1.1 动物与细胞 清洁级SD大鼠18只,体重约200~250g,雌雄各半,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,许可证号:SCXK(泸)2013-0016。小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞由上海中科院提供。
1.2 中药含药血清的制备 加味麻杏石甘汤水煎剂组方:炙麻黄9g、石膏18g、杏仁12g、银花9g、甘草6g 等组成,委托浙江中医药大学药学院采购并制备,浓缩为含生药2.44g/ml的中药药液。分装于等量真空中药袋中,4℃保存,备用。含药血清的制备:将18只清洁级大鼠随机分为2组,正常对照组6只,中药组12只。正常对照组给予生理盐水灌胃,中药组给予中药制剂灌胃。中药组大鼠按19.5g/d(4ml)中药给予灌胃(相当于成人剂量的15倍),用于制备含药血清。2次/d,连续给药3d,末次给药2h后采血。3d后以10%水合氯醛腹腔麻醉,在腹主动脉取血,分别制备血清,灭活、过滤除菌、分管,同组血清混合,分装至1ml离心管中,-20℃冻存,4周使用,避免反复冻融。
1.3 试剂及仪器 主要试剂:ERK抑制剂:U0126(S1102,Selleck);P-GSK3β(Ab75745,abcam 公司);E-cadherin(#14472)、Vimentin(#5741)、α-SMA(#19245)、ERK(#9102)、P-ERK(#9101)、Snail(#3879)、GSK3β(#12456)、GAPDH(#5174) 均购自CST公司。主要仪器:细胞培养耗材(TR4001、TR4002、TR5000,TRUELINE);透射电子显微镜(1230,JEM);激光共聚焦显微镜(fv1000,奥林巴斯)。
1.4 细胞模型的建立 采用总剂量5Gy,3.64Gy/min将小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行放射线照射,建立模型[5]。
1.5 分组 实验分为5组:正常大鼠血清组(使用含6%正常大鼠血清配置的完全培养基培养细胞;模型+正常大鼠血清组(细胞照射后使用含6%正常大鼠血清配置的完全培养基培养细胞);模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组(细胞照射后使用含6%正常大鼠血清配置的完全培养基培养24h后,并加入10μM U0126处理细胞24h);模型+含药大鼠血清组(细胞照射后使用含6%含药大鼠血清清配置的完全培养基培养);模型+含药大鼠血清+ERK抑制剂组(细胞照射后使用含6%含药大鼠血清配置的完全培养基培养24h后,并加入10μM U0126处理细胞24h)。
1.6 观察指标 Western blot检测细胞表型蛋白及信号通路主要蛋白;激光共聚焦显微镜观测snail转核。
1.7 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料采用(±s)表示,两组间比较用t检验,多个样本均数间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 Western blot检测细胞表型蛋白及信号通路主要蛋白比较 (1)小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞snail水平:与正常血清组比较,模型+大鼠血清组snail上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清组比较,模型+正常大鼠血清+siNC组差异无统计学意义(P>0.05),模型+含药血清组、模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组、模型+含药血清+ERK抑制剂组,snail浓度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组比较,模型+含药血清+ERK抑制剂组snail浓度下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞E-cadherin水平:与正常血清组比较,模型+大鼠血清组E-cadherin浓度降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清组比较,模型+正常大鼠血清+siNC组差异无统计学意义(P>0.05);与模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组比较,模型+含药血清+ERK抑制剂组E-cadherin浓度升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞p-GSK-3β水平:与正常血清组比较,模型+大鼠血清组p-GSK-3β上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清组比较,模型+正常大鼠血清+siNC组差异无统计学意义(P>0.05),模型+含药血清组、模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组、模型+含药血清+ERK抑制剂组,p-GSK-3β浓度下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组比较,模型+含药血清+ERK抑制剂组p-GSK-3β下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞p-ERK水平:与正常血清组比较,模型+大鼠血清组p-ERK上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清组比较,模型+正常大鼠血清+siNC组差异无统计学意义(P>0.05),模型+含药血清组、模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组、模型+含药血清+ERK抑制剂组,p-ERK浓度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型+正常大鼠血清+ERK抑制剂组比较,模型+含药血清+ERK抑制剂组ERK浓度稍降低,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。
图1 Western blot检测细胞表型蛋白及信号通路主要蛋白
表1 Western blot检测细胞表型蛋白及信号通路主要蛋白灰度值(±s)
表1 Western blot检测细胞表型蛋白及信号通路主要蛋白灰度值(±s)
注:与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,△P<0.05,△△P<0.01
snail E-cadherin p-GSK-3β p-ERK空白对照组 1.00±0.38 1.00±0.02 1.00±0.13 1.00±0.23模型对照组 3.22±0.27* 0.28±0.12* 2.65±0.22* 2.78±0.29*模型+正常血清+ERK抑制剂组 2.56±0.38△ 0.54±0.08△ 2.08±0.16△△ 2.14±0.21△△模型+含药血清组 1.16±0.16△ 0.38±0.06△ 1.22±0.20△△ 1.69±0.14△△模型+含药血清+ERK抑制剂组 1.83±0.20△△ 0.76±0.10△△ 1.98±0.10△△ 2.02±0.18△△
2.2 激光共聚焦显微镜观测snail转核 激光共聚焦观察snail转核结果显示,模型组与空白对照组比较,snail明显增加。含药血清组与模型组比较,snail减少,加入ERK抑制剂及沉默TGF-β基因后,snail表达减少。
放射性肺损伤的发生发展过程复杂,包含一系列细胞和分子的变化,其机制包括肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞损伤,肺组织分泌大量的炎性细胞因子、趋化因子和生长因子,吸引更多的炎性细胞聚集,而炎性损伤部位周围有促纤维细胞因子表达和成纤维细胞增殖分化,形成肺纤维化[6-8]。
中医认为,放射线属于热邪,首犯肺脏,肺为娇脏,感受火邪,耗气伤阴,炼液成痰,灼血成瘀,致肺燥阴伤、瘀血内阻,结合研究放射性肺纤维化热毒壅盛-气阴亏虚-痰瘀互结的病机演变过程,放射性肺纤维化治疗多以清热解毒、养阴生津、化痰祛瘀法为指导思想[9]。麻杏石甘汤出自《伤寒论》,方中用麻黄宣肺,石膏清肺,杏仁降利肺气,甘草益气和中,以达辛凉解表、清肺平喘功效,前期有研究采用麻杏石甘汤为基础,加桑白皮、金银花等组成加味麻杏石甘汤能够明显减轻放射性炎性损伤[10]。
在EMT过程中,上皮细胞逐渐失去极性并获得间充质,具有增强迁移潜力的特征,α-SMA、间质蛋白被释放对肌成纤维细胞活化的反应并给予强烈的反应收缩性能[11]。E-cadherin是一种上皮标记物,主要参与细胞间相互作用的维持,保持细胞的结构完整性[12]。Snail是一个E-cadherin的调节剂,帮助上皮细胞发育,进入成纤维细胞样迁移间充质细胞[13]。糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)可以通过与snail形成复合体,维持上皮细胞形态,促进其蛋白酶的降解来抑制 Snail的表达水平[14]。GSK3β 可被包括 PI3K/AKT[15]和 ERK1/2 MAPK[16]在内的多种信号转导通路灭活,从而上调Snail的表达水平,诱导 EMT。有研究显示ERK可磷酸化灭活GSK3β(Ser9 位点)[17],snail被释放,恢复活性。在本实验中,为了确定ERK轴信号是否影响GSK3β磷酸化,从而选择ERK抑制剂U0126。结果发现,蛋白质印迹和免疫荧光分析显示辐射增加GSK3β(S9)的磷酸化并被刺激细胞中的snail核移位。数据表明辐射增强GSK3β磷酸化丝氨酸9活性部位,导致其与snail分离,从而促进snail的核移植。
加味麻杏石甘汤减弱辐射诱导的磷酸化GSK3β和改变细胞中Snail,α-SMA和E-钙粘蛋白的蛋白水平(P<0.05),EMT抑制剂作用于模型+正常血清组后GSK-3β、snail浓度明显下降(P<0.05),加入ERK抑制剂的含药血清作用后,GSK-3β、snail仍较加入抑制剂的正常血清组有所下降(P<0.05),且ERK浓度差异无统计学意义,这可能与中药多靶点调控多种信号通路有关,即加味麻杏石甘汤也有可能通过其他途径调控GSK-3β/snail通路,需要进一步研究。