生防菌株LB-1对烟草白粉病的抑制效果及对病菌孢子萌发的影响

刘彩云，许瑞瑞，刘春香

潍坊学院生物与农业工程学院“十三五”山东省高等学校生物化学与分子生物学重点实验室，山东潍坊 261061

烟草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）[1-2]或奥隆特高氏白粉菌（Golovinomyces orontii）[3]侵染引起的病害。两种白粉病菌都可通过分生孢子产生初生芽管、附着胞，并以吸器从寄主细胞获取营养物质从而导致烟草叶片枯黄、整株枯死、调制后缺乏弹性和香气[2-4]。目前我国烟草白粉病防治以化学防治为主，生防菌研究较少。已报道的对烟草白粉病具有生防效果的微生物有云芝菌（Coriolus versicolor）[5]、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）[6]、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）[7]、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）[8]等。

毛壳菌（Chaetomium spp.）是一类极具生防潜力的真菌类群[9]，被报道具有生防作用的有球毛壳（C.globosum）[10-12]、螺旋毛壳（C.spirale）[13]、角毛壳（C.cupreum）[14]等，但毛壳菌应用于烟草白粉病防治的研究鲜有报道。本研究前期筛选获得一株近缘毛壳菌株LB-1，该菌株对多种植物病原真菌都具有很好的拮抗作用[15]。本文以白粉病感病烟草品种中烟90[4]为供试材料，研究了LB-1对烟草白粉病的抑制效果及对病菌分生孢子萌发的影响，为烟草白粉病的生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

中烟90种子由中国农业科学院烟草研究所提供。采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基（20%土豆煎汁、2%葡萄糖、2%琼脂粉）培养生防菌株LB-1，采用马铃薯葡萄糖液态（potato dextrose broth，PDB）培养基（20%土豆煎汁、2%葡萄糖）振荡培养获得LB-1发酵液，采用琼脂保鲜培养基（0.6%苯并咪唑，2%琼脂粉）培养烟草离体叶段。

1.2 方法

1.2.1 盆栽烟苗的培育、接种

中烟90种子催芽后播种于育苗盘中，隔离培育（17～25℃，自然光照）至成苗期后移栽到小花盆中。烟苗隔离培养7 d后采用孢子沉降法接种烟草白粉病菌，即放置盆栽苗于接种筒底部，将预先繁殖的新鲜烟草白粉病菌通过黑色纸卷从接种筒上部吹入，使病菌孢子散落在接种筒底部的盆栽苗上。

1.2.2 菌株LB-1菌悬液和发酵液的制备

刮取PDA平板上预先培养的LB-1菌丝体，用无菌生理盐水稀释为1×105cfu/mL的菌悬液；以体积比1:10的比例接于PDB培养液中，25℃、120 r/min振荡培养15 d，培养液经双层纱布过滤，4℃、12000 r/min条件下离心15 min，上清液即为LB-1发酵液。

1.2.3 菌株LB-1对烟草白粉病的抑制作用

盆栽苗测定：烟草盆栽苗在接种白粉病菌前和接种后24 h分别叶面喷施LB-1发酵液和菌悬液各1次（每株烟苗喷施20 mL），继续隔离培养（17～25℃，自然光照）至对照植株叶片充分发病后，参照国标烟草病虫害分级及调查方法[16]分析并计算病情指数和防效。每一处理设15盆烟苗（每盆1株）。调查时每个植株从顶部第3个叶片开始，向下取3个叶片。对照植株接种前和接种后24 h分别用无菌蒸馏水喷施一次（每株烟苗喷施20 mL）。

离体叶段测定：剪取健康烟草植株主脉两侧的叶片组织，在菌株LB-1发酵液和菌悬液中分别浸蘸后，正面朝上放置在琼脂保鲜培养基平板上，孢子沉降法接种后培养8 d（22℃，12 h光照），调查离体叶段上的病斑数，计算抑制率[17]。每个处理设9皿，每皿2个叶段。为使LB-1菌悬液和发酵液在烟草叶片上更好的附着，LB-1发酵液和菌悬液中分别加入了0.03%的吐温20[18]，并在实验中设置0.03%吐温20处理，对照为无菌蒸馏水处理。

1.2.4 菌株LB-1发酵液对白粉病菌孢子萌发的抑制作用

采用孢子沉降法接种烟草白粉病菌于薄层PDA平板，每皿喷施LB-1发酵液1 mL，22℃、自然光照下培养。2 h、18 h后培养皿直接置于相差显微镜下观察白粉病菌孢子萌发情况，统计孢子萌发率，并观察孢子和芽管的形态。处理和对照各设5个培养皿的重复，统计孢子萌发率时每个培养皿随机取3个视野，每视野萌发孢子占总观察孢子的比例为萌发率。孢子初生芽管长度超过孢子体一半即视为萌发。对照为无菌水处理。

1.3 数据分析

采用SAS 8.1对试验数据进行统计分析，采用最小显著差异法（LSD）检验各实验数据之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 菌株LB-1对烟草白粉病的抑制作用

菌株LB-1对烟草盆栽苗和离体叶段白粉病的抑制作用检测结果如表1、表2所示。LB-1菌悬液叶面处理对烟草白粉病发生无明显影响，但LB-1发酵液能显著降低中烟90叶片白粉病的发生程度，烟草盆栽苗和离体叶段上的防效和抑制率分别为44.90%和53.11%。0.03%吐温20作用效果甚微。

表1 LB-1菌悬液和发酵液对烟草盆栽苗白粉病发生的影响Tab.1 Effects of LB-1 suspension and culture broth on tobacco powdery mildew in pot seedlings

表2 LB-1菌悬液和发酵液对烟草离体叶段白粉病发生的影响Tab.2 Effects of LB-1 suspension and culture broth on tobacco powdery mildew in detached-leaf segments

2.2 菌株LB-1发酵液对烟草白粉病菌孢子萌发的抑制

接种在薄层PDA平板上的烟草白粉病菌孢子经LB-1发酵液喷施处理后，对孢子萌发影响不明显，发酵液和对照处理的孢子萌发率分别为81.79%和89.70%，但发酵液处理的孢子体出现了皱缩畸形（图1A），而对照无菌水处理的孢子则表现正常（图1B）；18 h时，LB-1发酵液处理的孢子虽然萌发产生了芽管，但是芽管短，有的出现了分叉，孢子体皱缩畸形（图1C），而对照无菌水处理的孢子则发育正常，形成了附着孢（图1D）。

图1 菌株LB-1发酵液处理的烟草白粉病菌孢子萌发特点Fig.1 Characteristics of conidia germination of E.cichoracearum DC treated by LB-1 culture broth

3 讨论

蔡琳等[8]研究发现，枯草芽孢杆菌第2次和第3次叶面处理后对烟草白粉病田间防效分别为44.93%和71.58%；而王静等[6]研究发现，短小芽孢杆菌AR03不同浓度菌悬液处理对烟草白粉病的防治效果也存在显著差异。本研究中近缘毛壳菌株LB-1发酵液在接种白粉病菌前后叶面处理烟草盆栽苗2次，可获得44.90%的防效，与蔡琳等[8]测定的枯草芽孢杆菌作用效果相当。

LB-1发酵液能够引起烟草白粉病菌孢子皱缩，芽管发育畸形，这表明发酵液中含有影响病菌孢子生长发育的活性物质，但活性物质及其作用机理还有待于明确。LB-1菌悬液对烟草白粉病菌无明显生防效果，这表明LB-1菌体与烟草白粉病菌无直接互作，但LB-1是否能够通过定殖烟草叶片发挥生防作用还有待于进一步检测。