一株鞘氨醇单胞菌对复烤后烟叶多酚物质的降解作用

冯颖杰，袁岐山，杨宗灿，张婷婷，刘向真，李成刚，王二彬，马胜涛，张展

河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南省郑州市陇海东路72号 450000

微生物在烟叶的发酵过程中扮演着重要的角色[1-2]，能够将转化烟叶中的大分子物质降解成小分子致香成分，从而改善烟叶品质，缩短醇化周期[3]。筛选不同的微生物菌株应用于烟叶发酵已获得了行业内的普遍认可[4]。

多酚类物质主要包括绿原酸、芸香苷、莨菪亭等，是烟叶的重要组分，对于烟叶的色泽、烟香和吃味等指标起重要影响[5]。复烤后烟叶中多酚氧化活性显著下降[6]，在烟叶自然醇化的过程中，多酚物质的降解十分缓慢[7]。多酚物质自身具有涩感，多酚氧化后可与蛋白质、氨基酸等发生美拉德反应生成多种致香组分[8-10]，可使烟香更加丰富，烟气更为醇和，对于改善烟叶品质具有积极作用[11-12]。因此，开发微生物技术调控复烤后烟叶中多酚物质的降解转化，对于加速烟叶醇化、改善烟叶品质具有重要价值。

鞘氨醇单胞菌是一类可降解多环芳烃和酚类物质的微生物，可在高度贫营养和恶劣条件下存活，分布广泛[13]，具有良好的环境适应性和耐受性，已有报道鞘氨醇单胞菌可用于生产胡萝卜素和生物胶等[14-15]。本研究团队前期从烟叶环境中分离得到一种可以降解多酚的鞘氨醇单胞菌，命名为Sphingomonassp.XP[16]。本文拟在此基础上，利用鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.XP对烟叶进行发酵处理，研究菌株对烟叶中多酚物质的转化降解作用，为开发适用于改善烟草品质的新型微生物技术提供新的思路和参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

选用2014年复烤后烟叶，由河南中烟工业有限责任公司提供（见表1）；

表1 烟叶样品Tab.1 Tobacco leaf samples

绿原酸（纯度≥98%）、咖啡酸（纯度≥98%）、3,4-二羟基苯甲酸（纯度≥98%）、甲醇（色谱纯）均购自Sigma；其他试剂均为国产色谱纯或分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

CGA培 养 基：Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，绿原酸2.0 g，加无菌去离子水补足 1 L。

1.2 仪器

Agilent 1200高效液相色谱，配备自动进样器（美国Agilent公司）；AutoAnalyzer3连续流动分析仪（德国Seal公司）；IRAffinity-1红外光谱仪（日本岛津公司）。

1.3 菌株培养

菌液制备：挑取活化培养后的单菌落至250 mL CGA液体培养基中，30 ℃，200 rpm震荡培养，菌液吸光度 （OD600） 为1.0时取出，4000 rpm冷冻离心5 min，弃上清液，菌体用200 mL 无菌水重悬，反复3次，菌悬液作为发酵菌液备用，菌液浓度约为2.4×108CFU/mL。

1.4 烟叶发酵

取500g烟叶样品，调整菌液pH为7.0，按照烟叶干重的不同比例喷施菌液，并用无菌水调整烟叶水分至25%，反复掺配，确保菌液在烟叶中分布均匀。以不添加菌液的无菌水处理烟叶作为对照组。将处理后的烟叶置于湿度为65%的恒温恒湿箱中发酵，定期取样分析。

1.5 主要化学成分检测

烟叶中主要多酚物质和常规化学成分的检测参照烟草行业现行标准[17-23]。

1.6 感官评价

样品制备及评吸方法参照文献[24-25]方法，采用盲评的形式，组织10人的评价团队进行对比评吸，将对照样每项感官评价指标均设定为0 分，试验样品评价与对照样相比：“+”表示指标改善，“－”表示指标变差，“0”表示指标无差异；各项评价指标均按平均值计算。

1.7 数据分析

试验数据采用Minitab 16.1.0统计软件进行分析。采用成对比较T检验进行统计分析发酵样品组与对照样品组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 菌株发酵条件单因素优化

以河南洛宁上部烟叶K为试验材料，优化菌株对烟叶中绿原酸、芸香苷和莨菪亭等主要多酚物质降解的发酵条件。

2.1.1 接种菌液比例的影响

在25 ℃条件下发酵30 d，考察不同接种量对烟叶中主要多酚物质的变化影响，如图1所示，与无菌水（对照）相比，接菌量的增大使绿原酸和芸香苷的含量呈现先降低后升高的趋势，而莨菪亭含量基本保持稳定。当接种量为烟叶干重的15%时，绿原酸和芸香苷含量最低，分别为10.6 mg·g-1和8.0 mg·g-1；增加接种量至20 wt%，绿原酸和芸香苷含量反而增大。这可能是由于进一步提高菌液添加量后，菌株在长时间的生存竞争中生物量降低，反而不利于多酚物质降解。因此，后续研究中以接种量占烟叶干重的15 wt%。

2.1.2 发酵温度的影响

结合实际生产气温条件，主要考察了15～30 ℃不同温度条件下发酵30 d后烟叶中多酚的变化，结果如图2所示。在15 ℃条件下发酵后，烟叶中的绿原酸、芸香苷和莨菪亭含量几乎不变，在20～30 ℃之间，烟叶中的绿原酸和芸香苷含量随着发酵温度的升高而下降，这可能与菌株在温度较高的环境下生长较快有关。因此将最佳发酵温度定为30 ℃。

2.1.3 发酵时间的影响

发酵时间对菌株降解烟叶中主要多酚物质的作用效果如图3所示。随着发酵时间的延长，绿原酸和芸香苷含量逐渐降低，而莨菪亭含量没有明显的降低。烟叶发酵30 d后，绿原酸含量由13.3 mg·g-1下降至10.4 mg·g-1，降低21.8%；芸香苷含量由9.6 mg·g-1下降至7.9 mg·g-1，降低17.7%。继续延长发酵时间至36 d，绿原酸和芸香苷含量降幅较小。因此，将最佳发酵时间确定为30 d。

图1 菌液添加量对多酚降解的影响Fig.1 Effect of inoculum size of bacteria on the degradation of polyphenols

图2 温度对多酚降解的影响Fig.2 Effect of temperature on the degradation of polyphenols

图3 发酵时间对多酚降解的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the degradation of polyphenols

2.2 烟叶发酵效果

为进一步验证鞘氨醇单胞菌发酵对烟叶的作用效果，本研究对不同复烤模块烟叶进行了发酵处理，并以添加等量无菌水的烟叶为对照样，测定发酵前后烟叶中主要多酚物质和常规化学成分的变化。

2.2.1 主要多酚物质的变化

发酵后各处理烟叶中绿原酸、芸香苷和莨菪亭等主要多酚物质的含量变化如表2所示。结果表明：与对照样相比，发酵样中的绿原酸和芸香苷含量普遍降低，降解率分别为8～32 %和6～25 %。统计分析处理组和对照组，发现鞘氨醇单胞菌发酵对于烟叶中的绿原酸和芸香苷具有显著的降解作用，而对于莨菪亭没有显著的降解作用。不同烟叶中绿原酸和芸香苷的降低幅度各不相同，这可能是由于不同烟叶表面的微环境有所差异。

2.2.2 常规化学成分变化

发酵后烟叶中主要常规化学成分的变化如表3所示。从表中可以看出，与对照样相比，烟叶中的还原糖和总糖含量显著增加，这对于提高烟叶品质具有有利影响。烟叶发酵后淀粉含量显著下降，表明菌株对淀粉也有降解作用。烟叶发酵样中总氮、总植物碱、蛋白质等含量没有显著变化，表明菌株不具有明显的降蛋白质和植物碱的功能。

2.2.3 感官质量变化

发酵处理烟叶和对照烟叶的感官质量评价结果见表4。可以看出发酵后烟叶与对照样品相比感官质量总体得分提高，主要表现为香气质和香气量有所提升，回甜增加，余味干净舒适。

表2 烟叶主要多酚物质含量Tab.2 Content of major polyphenols in tobacco leaves

表3 烟叶常规化学成分Tab.3 Content of routine chemical components in tobacco leaves

表4 感官质量对比差异Tab.4 Comparison of smoking quality

3 讨论

林丽等[26]利用高通量测序技术对烟草根、茎、叶本源的微生物菌群进行了鉴定，发现鞘氨醇单胞菌属为两大优势菌之一，这表明鞘氨醇单胞菌属在烟草中应用具备安全性和合理性。但是利用鞘氨醇单胞菌改善烟草品质的相关研究仍基本处于空白。

多酚物质与烤烟香气密切相关，多酚物质的降解有降低复烤后烟叶苦涩味、增加香气的效果[27]。然而在自然醇化过程中，复烤后烟叶的多酚物质降解缓慢。陈颐等[7]探究了不同产地、不同部位片烟醇化过程中多酚物质的变化，结果表明大部分烟叶在自然醇化的条件下多酚物质降低20%～30%，至少需要经过半年或一年的时间。赵铭钦等[28]通过控制醇化的高温高湿环境增加烟叶多酚的降解率，经过2年时间的醇化，绿原酸和芸香苷的降解率最高达到24%和34%。本研究利用鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.XP对复烤后烟叶发酵处理，可同时加速绿原酸和芸香苷的降解，降解率最高达到32%和25%，利于有效缩减醇化的时间，提高效率。

前期研究表明，菌株Sphingomonassp.XP代谢绿原酸的主要中间产物是芳香有机酸，是重要的香气前体物质[16]。此外，实验中发现经发酵处理的烟叶中总糖和还原糖的含量显著增加，淀粉含量显著降低。有研究[29]表明鞘氨醇单胞菌可利用淀粉作为碳源。因此，在发酵过程中，鞘氨醇单胞菌对烟叶中的淀粉有降解作用，导致还原糖含量升高。此外，鞘氨醇单胞菌可能分泌胞外多糖类物质[30]。因此，经发酵处理后卷烟感官品质得到明显改善。

4 结论

本研究利用鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.XP发酵处理复烤后烟叶，实现了烟叶中绿原酸和芸香苷等多酚物质的降解。结果表明，发酵处理对烟叶中绿原酸和芸香苷具有显著降解作用，而对于莨菪亭的降解没有显著作用；发酵后烟叶总糖、还原糖含量显著增加；淀粉含量显著降低，而总氮、总植物碱和蛋白质等含量没有显著变化；与对照组相比发酵后烟叶感官质量提高。本研究为拓展鞘氨醇单胞菌在烟草中的应用奠定了基础，为开发改善烟叶品质的新型生物制剂提供了新的思路。未来工作中应进一步探明微生物代谢作用机理，有效指导和改善烟叶发酵过程。