类芽孢杆菌发酵原料浸提液提升再造烟叶品质

叶建斌，王璐，杨峰，闫记，杨雪鹏，马科，樊新顺，田晓辉，郝辉，毛多斌，张展

1 郑州轻工业学院，郑州市高新技术产业开发区科学大道166号 450001；

2 河南省中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市陇海东路72号 450000；

3 河南卷烟工业烟草薄片有限公司，河南省许昌市金叶大道666号 461000

再造烟叶是利用烟草废弃物资源重组加工制成的烟草薄片，是卷烟不可或缺的重要原料。提升再造烟叶品质，对于充分利用烟草资源、改善卷烟感官质量具有重要意义[1-2]。生产中通常将烟草原料浸提液浓缩后涂布于再造烟叶表面，从而赋予其丰富的烟草香气。因此，浸提液的优劣直接影响再造烟叶感官风格和品质。

生物发酵技术具有绿色安全、低耗高效等特点，对于改善再造烟叶品质具有重要作用[3]。当前，许多研究人员尝试利用酶制剂或微生物对浸提液进行发酵处理，改善再造烟叶品质。朱国成等[4]采用淀粉酶、糖化酶以及纤维素酶对薄片原料（烟梗、烟末）进行处理，考察了浸提液中糖类物质的变化。吴亦集等[5]利用蛋白酶、果胶酶和半纤维素酶处理烟梗和烟末浸提液，考察了其对还原糖和氨基酸含量的影响。张勃等[6]采用从烟叶表面分离的两株菌株对烟梗水提物进行发酵处理，发现处理后再造烟叶的致香组分增加，感官品质改善。这些生物处理手段，可以促进大分子物质降解、降低杂气，同时糖和氨基酸等在处理过程中会通过美拉德反应生成大量致香物质，有利于烟叶品质的改善。然而目前微生物技术在烟草中应用的研究仍十分有限，烟草中丰富的微生物资源有待进一步挖掘。

类芽孢杆菌广泛存在于土壤和烟草表面[7-8]，但是少有利用该类微生物发酵烟草原料浸提液的相关报道。本课题组前期从烟叶表面分离获得了一株类芽孢杆菌，可利用烟草浸提液生长，适应性良好[9]。研究中发现该菌株处理的浸提液香气良好，可能有利于改善再造烟叶品质。因此，本研究收集该微生物的静息细胞用于发酵再造烟叶原料浸提液，重点考察发酵过程中浸提液内蛋白质、氨基酸、糖等物质含量的变化，并对成品再造烟叶热裂解主要致香成分进行分析，结合感官评价开展再造烟叶应用效果验证，旨在为利用生物技术改善再造烟叶品质提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试烟末、烟梗、碎烟片混合物由河南中烟许昌薄片厂提供。类芽孢杆菌为实验室从烟叶表面分离并鉴定的菌株[9]。

LB固体培养基（商品化试剂）、二氯甲烷（≥99%）、乙酸苯乙酯（99.5%）、无水硫酸钠（分析纯）（北京百灵威科技有限公司）；硫酸钾、次氯酸钠、水杨酸钠、酒石酸钾钠、聚乙氧基月桂醚、磷酸氢二钠，以上试剂均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

Agilent 6890-5973气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；CDS5200热裂解仪（美国CDS公司）；AA3-连续流动分析仪（德国布朗卢比公司）；KL512J数控恒温水浴锅（上海鸿经生物仪器制造有限公司）；BLBIO-5GC自动发酵罐（上海百仑生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原料浸提液制备

原料浸提液制备：准确称取0.5 kg烟末、烟梗及碎烟片（混合物），加入3 kg热水，于 55℃下浸取1 h，过滤，获得浸提液。

1.2.2 浸提液发酵

1.2.2.1 静息细胞的制备

采用LB培养基将类芽孢杆菌培养到OD600值为1.2左右停止（此时细胞浓度约为109个细胞/mL），离心去掉培养基，收集细胞置于pH为7.2的PBS缓冲液中，作为静息细胞备用。

1.2.2.2 发酵处理

取2 kg浸提液置于自动发酵罐中，加入0.2 g类芽孢杆菌静息细胞，控制在30 ℃，150 r/min，pH 6.0，溶氧25%条件下发酵。间隔一定时间，取样分析。实际生产中，浸提液通常存放5 h以内[10]。因此，为满足工业生产需求并最大限度考察类芽孢杆菌对浸提液的作用效果，将发酵时间控制在5 h。

1.2.2.3 对照样品发酵

对照发酵样品是将浸提液采用上述相同条件处理，但不加入类芽孢杆菌静息细胞。

1.2.3 浸提液分析

1.2.3.1 氨基酸、糖和蛋白质的测定

浸提液中的总游离氨基酸、还原糖含量的测定分别依照标准方法GB/T8314-87《茶游离氨基酸总量测定》[11]、YC/T159-2002《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》[12]。蛋白质含量的检测按照文献Bradford法进行[13]。每个检测过程重复3次，计算标准误差。

1.2.3.2 挥发性香味成分的测定

样品前处理：取发酵后浸提液200 mL，同时蒸馏萃取2 h，萃取液中加入12 g无水硫酸钠，于室温放置过夜， 55 ℃下旋转蒸发浓缩至1 mL，加入内标溶液1 mL，经过0.22 μm滤膜过滤至气相瓶，待测。

色谱柱： HP-5MS（60m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度：250 ℃；载气流速：1.0 mL/min；分流比：10:1；进样量：2 μL；程序升温条件：柱初温70 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至175 ℃，保持20 min，再以1 ℃/min升至220 ℃，保持20 min。质谱条件：电子轰击源（EI），电子能量: 70 eV，离子源温度：230 ℃，传输线温度：240 ℃，四级杆温度: 150 ℃，质谱扫描范围: 50～450 u。利用Nist数据库对采集的数据进行定性分析，以乙酸苯乙酯为内标进行定量分析，每个样品平行做2次，求平均值。

1.2.4 再造烟叶样品分析

1.2.4.1 再造烟叶样品制备

在55 ℃将浸提液用旋转蒸发仪浓缩到26波美，涂布到再造烟叶基片上，控制涂布率39%，得到涂布再造烟叶样品。将样品在22 ℃，空气湿度65%的恒温恒湿箱中，平衡48 h后备用。

1.2.4.2 再造烟叶样品热裂解产物分析

称取样品2 mg放入裂解仪进行裂解分析，裂解产物直接导入GC/MS进行分离鉴定。热裂解氛围：大气环境，热裂解探头初始温度：50 ℃，以20 ℃/ms升温速度升至700 ℃，并保持10 s。

色谱柱： DB-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；载气：氦气，99.999%；流速：1 mL/min；分流比50:1；程序升温：50 ℃保持1 min，3 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，5 ℃/min升至250 ℃，保持20 min；离子源：电子轰击源（EI）；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；质谱扫描范围50～450 u。通过NIST11谱库比对，已匹配度≥80%者定性；采用峰面积归一化法定量，以各化合物色谱峰面积的相对百分比表示其相对含量。

1.2.5 感官评价

将平衡后的再造烟叶切丝卷制成卷烟进行感官评价。感官评价由9位专业评吸员完成，参照YC/T498-2014再造烟叶（造纸法）感官评价方法[14]，执行河南卷烟工业烟草薄片有限公司现行标准。

2 实验结果

2.1 浸提液发酵过程中的组分变化

2.1.1 蛋白质总量的变化

浸提液发酵过程中蛋白质总量的变化如图1所示，随着发酵时间的延长，浸提液中蛋白质含量有所减少。其中，在类芽孢杆菌发酵（Cell组）的原料浸提液中蛋白质降解速率和最终降解量均高于对照组（CK组）的浸提液。Cell组和CK组的浸提液中起始的蛋白质含量接近，分别为6.40 mg/mL、6.32 mg/mL，经过5 h发酵，Cell组的浸提液中蛋白质减少为4.06 mg/mL，降解率为36.6%， CK组的浸提液中蛋白质减少为5.04 mg/mL，降解率为19.6%。

2.1.2 游离氨基酸总量的变化

发酵过程中氨基酸浓度呈现先增加后减少的趋势（图2）。2组浸提液中的最高值均出现在发酵3.5 h，其中Cell组中氨基酸的峰值（124.4 μg/mL）是CK组（63.3 μg/mL ）的2倍左右。在发酵3.5 h后，2组发酵液中氨基酸浓度均呈下降趋势， Cell组浸提液中的氨基酸浓度从最高峰减少到70.2 μg/mL ，CK组中则减少到45.6 μg/mL。

2.1.3 可溶性还原糖总量的变化

浸提液发酵过程中2组浸提液中的可溶性还原糖含量均表现出降低的趋势（图3），但Cell组的变化趋势要大于CK组。比较2组发酵液可知，CK组的还原糖从21.0 mg/mL减少到17.2 mg/mL，降解率为18.1%；而Cell组则从21.3 mg/mL减少到了14.8 mg/mL左右，降解率为30.5%。

2.2 浸提液致香成分

根据上述结果，3.5 h时Cell组和CK组浸提液中的氨基酸浓度达到最高，推测为微生物的最优发酵时间点。因此，为了研究微生物发酵对浸提液化学成分的影响，利用同时蒸馏萃取结合GC-MS方法对发酵3.5 h后的浸提液中的致香成分进行分析。2组样品中共检测出88种致香成分，其中CK组检测出48种致香成分，Cell组检测出83种，按官能团进行了分类，结果见附表1（因版面原因不在纸质版刊登，详见电子版）。

图1 蛋白质含量变化情况Fig.1 Changes of protein content

图2 氨基酸含量变化情况Fig.2 Changes of amino acid content

图3 可溶性还原糖含量的变化情况Fig.3 Changes of soluble reducing sugar content

对香味成分归类后发现，Cell组中的致香物质种类和部分物质的含量均有明显提高。结果显示酮类和烃类增幅最为明显，酸类和酯类次之，分别增加了10种、8种和7种、5种。如Cell组中愈创木烯为1.1384 μg/mL、茶香酮为1.0089 μg/mL、（1S,2E,4S,5R,7E,11E）-西松烷基-2,7,11-三己烯-4,5-二醇为0.5747 μg/mL，但这些均未在CK组中检出。这些特征香味物质都是烟草中重要的香味成份，对于烟草感官品质具有重要的影响[15]。

值得注意的是，Cell组中增加最为明显的是糠醛、糠酮类美拉德反应产物。该类化合物经微生物发酵的原料浸提液中总含量达到1.1811 μg/mL，要远高于CK组中的0.3737 μg/mL。Cell组中最高的是5-甲基糠醛，含量为0.5539 μg/mL，而CK组则未检出。2-乙基呋喃在Cell组中（0.2351 μg/mL）的含量则是CK组（0.0337 μg/mL）的6倍多。

在其他类型的香味物质中，CK组与Cell组的含量差异不大。如CK组中巨豆三烯酮的含量为0.9374 μg/mL，在Cell组中含量也为0.9370 μg/mL。醇类化合物中，Cell组和CK组中含量最高的均为金合欢醇，分别为0.6803 μg/mL和0.6782 μg/mL。酯类化合物中，二氢猕猴桃内酯在两组发酵液中都是主要的香味成分，分别为0.6548 μg/mL（Cell组）和0.6326 μg/mL（CK组）。酚类化合物中，两组均以4-乙烯基愈创木酚为主要成分，含量分别为0.2481 μg/mL（Cell组）和0.2324 μg/mL（CK组）。在N杂环类化合物中，Cell组和CK组的烟碱含量分别为0.9826 μg/mL和0.9285 μg/mL，占该类香味成分的一半左右，说明该微生物发酵并没有降低发酵浸提液中的烟碱类物质。

2.3 再造烟叶样品热裂解产物

为了确定微生物发酵浸提液对成品再造烟叶品质的影响，将发酵后的浸提液浓缩后涂布到再造烟叶片基上，通过热裂解质谱仪模拟进行燃烧分析比较了两组再造烟叶样品热裂解产物的差异，结果见附表2（因版面原因不在纸质版刊登，详见电子版）。

热裂解结果显示Cell组涂布制备的再造烟叶热裂解产物中的致香物质种类和相对含量均有明显提高。虽然Cell组中少部分香味物质的峰面积百分比表现出了减少，如减少较为明显的包括1-甲氧基-2-甲基-3-丁烯、4-环戊烯-1,3-二酮、4-乙基环己酮、3-羟基丁酸甲酯、2-甲基丙酸等。但将热裂解产物进行归类后，发现大部分香味物质的总体含量都有所增加，包括烃类、酮类、醇类、N杂环类、酸类、糠醛糠酮类、酚类等香味物质。

与CK组相比，Cell组中典型烟气香味物质均有所提高。如烃类香味物质增加最高的是柠檬烯，从0.8436%增加到1.2898%。酮类化合物中，羟基丙酮从2.2193%增加到3.0128% 。酯类化合物中， Cell组中γ-丁内酯的色谱峰面积相对百分比为0.5515%，而CK组中未检出。乙酸则是酸类成分中增加最为显著的物质，从2.1378%增加到3.1472% 。在糠醛糠酮类化合物中，增加最高的香味物质是2,3-二氢-5-甲基呋喃，在Cell组中该化合物的色谱峰面积的相对百分比为0.4725%，而CK组中未检测到。另一种增加较为明显的是糠醛，在Cell组和CK组中的色谱峰面积的相对百分比分别为1.4839%和1.0861%，烟气中的糠醛可以使卷烟表现出明显的焦甜或烤甜味[15]。

2.4 再造烟叶感官品质

为了确定微生物发酵原料浸提液可以提升成品再造烟叶的品质，进行了涂布发酵（Cell组）和未发酵浸提液（CK组）再造烟叶样品感官品质的差异比较，结果表明（表1），与CK组样品相比，Cell组的成品再造烟叶香气指标显著改善，主要表现为香气质和香气量增加，香气更加丰富。此外，Cell组产品的灼烧感和残留也有所改善，烟气更加细腻柔和圆润，其他指标变化不明显。发酵液涂布的产品总体感官得分由76.5分提高至78.8分，说明采用发酵涂布液促进了再造烟叶感官质量的提升。

表1 再造烟叶感官评吸结果Tab.1 Sensory evaluation results of reconstituted tobacco

3 讨论

本研究表明浸提液在发酵过程中蛋白质和还原糖逐渐减少，而氨基酸呈现先增加后减少的趋势。这可能因为烟草浸提物自身富含大量微生物[16]，在放置过程中存在发酵作用，故蛋白质、糖类逐渐较少。在发酵前期，氨基酸浓度的增加可能与蛋白质降解相关；在发酵后期，氨基酸浓度的减少可能与美拉德反应有关，也可能是部分氨基酸被微生物作为氮源进一步消耗掉。

本课题组前期研究证明[9]，类芽孢杆菌被证明对烟草浸提液具有较强的适应能力，能够在高还原糖浓度下有效降解浸提液中甾醇类化合物生成相应的酸类和小分子糖类物质。本研究结果显示，利用类芽孢杆菌静息细胞发酵浸提液，可以促进蛋白质分子的降解，从而使发酵液中的氨基酸浓度明显增加。有相关研究报道了烟草中的游离氨基酸含量[17-18]，但未见报道微生物发酵如何影响烟草浸提液氨基酸含量的变化。发酵过程中，还原糖含量的变化可能与如下几个因素相关：（1）微生物生长消耗还原糖；（2）还原糖与氨基酸发生美拉德反应；（3）大分子物质酶解或水解产生还原糖。本研究中，类芽孢杆菌静息细胞发酵浸提液虽然可以降解部分甾醇生成糖类物质，但由于该类底物含量较低，因此还原糖含量总体呈现下降趋势。

本研究表明类芽孢杆菌发酵浸提液中的美拉德反应产物明显增加。结合2组发酵液氨基酸浓度的差异，可初步推测这些美拉德反应产物与浸提液中氨基酸浓度的增加有一定的关联。综合分析结果表明，类芽孢杆菌静息细胞发酵可促进蛋白质降解生成氨基酸，而增加的氨基酸可能与发酵液中的糖类物质发生反应，从而推动了体系中的美拉德反应，实现了浸提液中香味物质的增加。Cell组浸提液中，其他香味物质的增加机理仍不明确，后期应进一步探索类芽孢杆菌是否可以降解烟草浸提液中的其他大分子物质，如果胶或少量可溶性纤维素。

本研究表明Cell组发酵浸提液制备的再造烟叶裂解产物中香味成份含量有所增高且感官品质也有所提升。可能因为浸提液在75℃下真空旋蒸[10]浓缩过程中一些小分子物质发生化学反应，生成部分致香前体物质，从而使得再造烟叶热裂解产物中香味物质有所增加。因此，添加类芽孢杆菌静息细胞发酵浸提液可促进部分小分子物质的生成，从而有利于促进浓缩过程致香前体物质的生成。因热裂解反应较为复杂，本研究尚无法客观评价致香物质的增加与具体哪些前体物质相关。但感官评价对比结果显示Cell组再造烟叶的香气明显增加，验证了裂解产物中香味物质的增加对于内在品质的提升效果。

4 结论

本研究利用一株从烟草原料中分离的类芽孢杆菌发酵再造烟叶原料浸提液并开展化学分析和感官评价，得到主要结论如下：

（1）与未添加微生物的浸提液相比，在发酵过程中添加类芽孢杆菌静息细胞具有辅助降解浸提液中蛋白质的作用，蛋白质降解速率快，最终蛋白质含量少。

（2）类芽孢杆菌静息细胞发酵可以促进浸提液中氨基酸和还原糖的反应，从而提高浸提液中香味成分种类和含量的增加。

（3）经类芽孢杆菌静息细胞发酵的浸提液中香味物质的增加以美拉德产物为主，包括糠醛、5-甲基糠醛、4-乙烯基愈创木酚、2-乙基呋喃。

（4）涂布类芽孢杆菌发酵浸提液获得的再造烟叶裂解产物中香味成份含量有所增高，最终感官品质有所提升。