S-433 D氨基酸分析仪测定水溶肥料中氨基酸的含量

河南省土壤肥料站 主办

随着我国农业的不断发展，化学肥料的大量施用，我国的土壤肥力，特别是有机质质量分数的下降趋势十分明显。为解决化肥过量施用带来的各种问题，改善农业生态环境，促进农业生产的可持续发展，开发、使用新兴的水溶肥料是今后农业生产中的必然趋势。氨基酸水溶肥料作为一种与立体高效栽培技术、高产优质栽培技术相配套的新型肥料，是未来肥料发展的重要方向之一。

采用S-433 D氨基酸自动分析仪测定含氨基酸水溶肥料中氨基酸的含量，可对目前人们所关注的所有氨基酸进行定性定量检测。目前，该方法已被《水溶肥料 游离氨基酸含量的测定》（NY/T 1975-2010）推荐使用，并列为仲裁法。但是标准中没有规定氨基酸分析的型号和样品含量的检测范围，因此，本文采用此方法测定水溶肥料中游离氨基酸的含量，分别研究了进样浓度和进样体积对氨基酸分离度的影响，以确定适宜的进样浓度和体积，然后对氨基酸自动分析仪法进行验证。

一、材料与方法

（一）试剂与仪器

1.试剂。0.06 mol/L的盐酸溶液；500 g/L的氢氧化钠溶液；50 g/L的磺基水杨酸溶液；10 g/L的EDTA-Na溶液；pH值为2.2的柠檬酸钠缓冲液；氨基酸混合标准溶液 2.5 ×109 nmol/mL。

2.仪器。S-433 D氨基酸分析仪；0.45μ m的微孔滤膜及过滤头、注射器等。

（二）测定方法

1.样品的制备。含氨基酸水溶肥料样品经多次缩分后，取出约100 g，将其研磨至全部通过0.50 mm的孔径过筛，混合均匀，置于洁净、干燥的容器中。

2.测定方法。称取试样2～10 g，置于250 mL的容量瓶中。充分溶解后，加水至刻度，混匀，过滤后吸取上清液2 mL于10 mL的离心管中，准确加入2 mL的磺基水样酸溶液，混匀，放置1 h。准确加入1 mL的EDTA-Na溶液和1 mL的盐酸溶液，混匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤。吸取滤液1 mL，蒸干。准确加入1～5 mL的柠檬酸钠缓冲液溶解，使氨基酸浓度处于仪器最佳检测范围内，供仪器测定用。

3. S-433 D氨基酸分析仪的色谱条件。色谱柱：SYKAMLCAK06/Na。流动相A：柠檬酸钠= 0.12 N，pH值为 3.45；流动相B：柠檬酸钠=0.2 N，pH值为10.85。流速：茚三酮溶液流速0.25 mL/min，洗脱液流速0.45 mL/min。检测器1：570 nm，双极的，12 123 mV，6.25样品数每秒；检测器2 ：440 nm，双极的，12 123 mV，6.25样品数每秒。反应温度：138 ℃。

（三）数据分析

本文运用IBM SPSS Statistics 20.0进行数据统计分析，用Microsoft Office Excel 2010制图。

二、结果与分析

（一）进样浓度和进样体积对氨基酸分离度的影响

为确定进样浓度和进样体积对氨基酸峰分离度的影响，试验按照双因素布置，进样浓度分别设为5nmol/mL、25 nmol/mL、100 nmol/mL 3个水平，进样体积分别设为5μL、25μ L、100μL 3个水平，共9个处理，每个处理重复3次。按照测定方法进行测定。经过校准、积分后，考察苏氨酸和丝氨酸峰形的分离度（Rh），计算公式为：

式中，H0为苏氨酸和丝氨酸平均峰高，单位为mm；H为苏氨酸和丝氨酸峰交点到基线的距离，单位为mm。

图1 苏氨酸-丝氨酸分离度随进样量的趋势

表1 进样浓度和进样体积对氨基酸分离度的方差分析（因变量：苏氨酸-丝氨酸分离度）

如表1所示，通过双因素分析，进样浓度和进样体积对氨基酸分离度的影响均达到极显著水平（p＜0.001），并且存在着极显著的交互作用（p＜0.001）。

由图1可知，在进样量＜0.5 nmol时，分离度随着进样量的增大而急剧增大；在进样量＞0.5 nmol时，分离度随着进样量的增加而缓慢增加，并且在5.0 nmol之后分离度随着进样量的增加而基本保持稳定。

（二）方法的验证

1.稳定性。取氨基酸含量约为15%的氨基酸水溶肥料，按照测定方法进行测定。由表2可知，24 h内17种氨基酸的RSD值均在1.5%以下。其中蛋氨酸的RSD最高，为1.43%；甘氨酸的RSD最低，为0.27%。总峰面积的RSD为0.23%。

2.重复性。按照测定方法测定氨基酸含量的RSD值。如表3所示，各氨基酸含量结果的RSD值均＜1.5%。组氨酸的稳定性最差，RSD为1.44%；天冬氨酸的稳定性最好，RSD为0.76%。总峰面积的RSD为0.51%。

三、结论

本文探讨了S-433D氨基酸分析仪的进样浓度和进样体积对分离度的影响，明确了适宜的进样浓度和进样体积，对测定方法进行了验证，得到以下结论：

（一）对于S-433 D氨基酸分析仪，分离度随着进样体积和进样浓度的增加而提高，保持绝对进样量为5 nmol时，即可得到较高的分离度；当进样体积为50μ L时，最适宜的上机浓度为100 nmol/mL。

（二）《水溶肥料 游离氨基酸含量的测定》（NY/T 1975-2010）氨基酸自动分析仪法中的进样体积为50μL时，在 0.25～50 nmol下，重复性和24 h稳定性的RSD均＜1.5%。

表2 17种氨基酸24 h内的峰面积及相对标准偏差

表3 17种氨基酸峰面积的重复性