土壤加硒对柴油胁迫下三叶草光合荧光特性的影响

席 颖 刘慧刚 袁 喜 张栋栋 任 东 黄应平

(1.三峡大学 水利与环境学院，湖北 宜昌 443002；2.湖北省农田环境监测工程技术中心，湖北 宜昌443002；3.三峡库区生态环境教育部工程研究中心(三峡大学)，湖北 宜昌 443002)

石油产品是复杂的烃类混合物，含有多环芳烃等有毒化合物[1].柴油作为一种典型的石油类碳氢化合物，对动物和人体健康构成威胁，对环境造成严重危害[2].因此，去除环境中柴油污染物成为一项亟待解决的事情.植物修复作为一项绿色环保的技术，其修复效率跟植物生长状况密切相关，植物生长状态越好，植物修复效率越高[3].植物的光合荧光特性是评价植物光合作用的重要指标，植物光合作用越强，植物生长状况越好，具有的植物修复潜能更大.污染土壤中的石油类碳氢化合物质量分数是限制植物生长的重要因素，研究表明高质量分数的柴油会对植物叶肉细胞叶绿素造成损伤，从而抑制植物光合作用，导致植物光合效率下降，影响植物正常生长[4].因此，需要研究一些添加物，能缓解多环芳烃对植物生长的胁迫作用，提高植物修复效率.

硒(Se)是一种有益的微量元素，低质量分数的硒对生物有益.Hartikainen[5]曾对硒对黑麦草生长的影响，发现当土壤硒质量分数大于10mg/kg时对植物出现了毒害作用，而当硒质量分数为0.1mg/kg时能促进植物生长.硒能在生物体内合成硒蛋白，硒蛋白能帮助生物清除体内因为胁迫产生的氧化自由基，从而增加了生物对污染物的耐受性.很多文献曾报道硒能增强植物在重金属、盐碱、干旱等胁迫下耐受性[6-8]，缓解污染物对植物生长的抑制，这些文献都是集中关于硒缓解重金属、干旱等污染物对植物胁迫的研究，关于硒对高质量分数柴油胁迫下植物生长影响的文献报道较少.有文献报道指出三叶草是一种植物修复常见植物物种，具有良好的吸收富集土壤污染物的能力[9].

本文以三叶草(Trifoliumrepens)为研究对象，通过测量三叶草在不同柴油质量分数胁迫下的光合荧光参数，来反映柴油对三叶草的光合作用的影响.通过比较不同质量分数柴油胁迫下加硒与对照组三叶草光合荧光参数的差别，探讨土壤加硒对于柴油胁迫下三叶草光合荧光特性的影响，以期为植物修复提供新思路和新方法.

1 材料和方法

1.1 试验土壤和植物

供试土壤取自三峡大学植物园内20～60cm 的土层.土壤pH，有机质、总磷、总氮、土壤粒径和硒的测定分别通过玻璃电极测定方法(NY/T 1377-2007)；重铬酸钾(NY/T1121.6-2006)；MoSb分光光度法(HJ632-2011)；凯氏定氮法(HJ717-2014)；比重法(FHZDZTR0008)；以及耦合等离子质谱法(ICPMS，Thermo Fisher Scientific，USA)进行.土壤pH值为7.41，有机质2.79g/kg，土壤总磷445.1mg/kg，总氮316mg/kg，土壤砂粒、粉粒、粘粒的百分比分别为32、57、11%，土壤硒本底值为0.02mg/kg.

供试植物取自三峡大学植物园内长势一致三叶草幼苗，平均株高(18±0.5cm)，所有幼苗进行3d预培养，然后移栽到实验盆内，每盆内选4颗健康幼苗.

1.2 实验设计

实验盆为6L容量，每盆装3000g过2mm 筛的细土.将柴油加入土壤中拌匀，形成质量分数为0，15，20，25g/kg 柴油污染土壤.再将硒(Na2SeO3)(Sigma，St.Louis，MO，USA)溶解于蒸馏水中制备硒质量分数为0.5mg/kg的Na2SeO3溶液加入实验组的盆中，对照组加入等体积的蒸馏水.充分搅拌均匀置于阴暗处平衡3d.将三叶草幼苗移栽到实验盆内.试验盆被分为4组：无硒对照组，加硒对照组，无硒实验组，加硒实验组.对照组为只有柴油污染的土壤无植物.实验组为柴油污染土壤及植物.4组试验组包含3个柴油质量分数，每个质量分数梯度设置3个重复.试验在户外大棚内进行，实验周期60d，实验过程中每3d浇一次水，保持土壤持水量约70%.

1.3 试验测定方法

在植物生长60d后，将植物从盆中小心拔出，用蒸馏水洗净，在根茎的分界处用剪刀分开，用干净抹布擦干，用天平分别称量根茎的鲜重.

选取植物从上往下数第二片完全生长扩展开的叶片，利用LI-6400XT 便携式光合仪(Li-COR，USA)测定植物净光合速率(Pn，μmol/m2/s1)、细胞间二氧化碳质量分数(Ci，μmol/mol)、气孔导度(Gs，mol/m2/s1)和蒸腾速率(Tr，mmol/m2/s1).光合参数的测定选择在晴天的上午约9：30～11：30的时间段进行.空气相对湿度，二氧化碳质量分数，以及光合作用光子通量密度(PPFD)分别为25℃、80%～90%、400μmol/mol和1000μmol/(m2·s-1).植物荧光参数也是采用相同的仪器，去植物从上往下数第二片完全扩展开的叶片，在经过30min的黑暗适应后进行荧光参数测定和计算最大光化学效率(Fv/Fm)、非光化学淬灭系数(qN)、光化学淬灭系数(qP)和PSⅡ实际光化学效率(ФPSⅡ).每盆取4片叶子计算平均值.具体测定方法参照Huang关于植物光合荧光的研究报道[10].

1.4 数据处理

每个处理均重复3次，数据结果以均值±标准误差来表示，采用SPSS17.0运用Duncan检验比较不同柴油质量分数对光合荧光参数影响的差别.运用Turkey检验来比较加硒和不加硒的区别.P＜0.05视为有显著性差异.采用Origin 8.0软件进行作图.

2 结 果

2.1 加硒对三叶草生长的影响

60d后，对三叶草根茎的鲜重进行称量，称量结果见表1，三叶草在高质量分数柴油胁迫下，植物的生长受到明显的抑制.植物茎鲜重在3个不同质量分数柴油胁迫下显著降低(P＜0.05)，根的鲜重在柴油质量分数为20、25g/kg时显著高于其在稍低质量分数时的根重(P＜0.05).茎和根的最大抑制率分别在最高质量分数处为55.3%和74.3%.由表1可知，植物处于最高质量分数柴油胁迫下根茎质量比最低，显示高质量分数柴油会对植物生长产生显著的胁迫.然而，加硒显著改善了柴油对三叶草的胁迫，加硒后，植物根茎鲜重得到显著改善(P＜0.05)，在15、20、25g/kg茎鲜重较不加硒对照组分别提高了5.8%、28.9%、28.9%，根鲜重提高了18.8%、36.2%、59.4%.加硒显著提高了根茎质量比，在柴油质量分数为25g/kg时提高了43%.

表1 硒对植物根茎鲜重及跟茎鲜重比的影响

2.2 加硒对三叶草光合特性的影响

如图1所示，三叶草光合参数除了Ci外，Pn、Gs和Tr都随着柴油质量分数的增加呈显著降低的趋势(P＜0.05).

试验结果表明：三叶草光合特性收到柴油的抑制.Pn、Gs和Tr在柴油质量分数为20g/kg时下降的最快；最低值均在柴油质量分数最高25g/kg时.而Ci随着柴油质量分数梯度的增加不断增加，在柴油质量分数为15g/kg时显著增加(P＜0.05)，在柴油质量分数为20，25g/kg时无显著性差异.加硒后，Pn、Gs和Tr相对于对照组得到了显著改善(P＜0.05).相对于不加硒的对照组，Pn 显著增加了49%、48%、18%、21%；Gs显著增加了24%、32%、32%、31%；Tr增加了14%、31%、11%、6%.Ci加硒后相对于不加硒组降低，但减少并不显著.

2.3 加硒对三叶草叶绿素荧光特性的影响

如图2所示，柴油胁迫下三叶草叶绿素荧光特性均发生了显著的变化.Fv/Fm、qP、ФPSⅡ随着柴油质量分数的增加显著降低(P＜0.05)；柴油质量分数为20g/kg和25g/kg时Fv/Fm、qP、ФPSⅡ无显著差异；在柴 油 质 量 分 数 为15、20、25g/kg，Fv/Fm、qP 和ФPSⅡ对比柴油浓度为0g/kg时分别降低了2.3%、3.7%、4.8%；30.1%、41.1%、53.4%；14.2%、32.7%、37.1%.qN 随着柴油质量分数梯度的升高呈现上升趋势，且低质量分数(0、15g/kg)与高质量分数(20、25g/kg)之间存在显著性差异，而两个高质量分数和低质量分数内部差异性并不显著(P＜0.05).然而，加硒显著增加了Fv/Fm、qP、ФPSⅡ值，表现为相对于不加硒对照组，Fv/Fm增加了4.1%、3.2%、1.4%、1.8%；qP 增 加 了11.4%、21.5%、19.2%、18.3%；ФPSⅡ增 加 了19.3%、19.6%、21.0%、14.4%.qN 表现为随着柴油质量分数升高逐渐增加的趋势；且低质量分数(0、15g/kg)与高质量分数(20、25g/kg)之间存在显著性差异，而两个高质量分数和低质量分数内部差异性并不显著.加硒后，这种增加的趋势得到控制，表现为相对于不加硒对照组，qP降低了1.3%、1.5%、2.1%、0.8%.

3 讨论与结论

植物的生长状况能指示植物生长环境.本研究发现植物的根和茎的鲜重受到柴油质量分数的显著抑制，且质量分数越高，抑制作用越明显.这个结果与Zhang等人关于藨草的研究结果一致[11].有文献报道指出根茎的质量比能反映植物受到的胁迫程度，低根茎比值指示植物受到更严重的环境胁迫[12].植物处于最高质量分数柴油胁迫下根茎质量比最低，显示高质量分数柴油会对植物生长产生显著的胁迫，与前人研究结论一致.然而加硒有效减少了柴油对三叶草的胁迫，缓解了植物生长受抑制的状况.硒是一种微量元素，低质量分数的硒能促进植物的生长[13]，因此在柴油质量分数为0g/kg时，三叶草的茎和根鲜重也有增加.关于硒改善植物生长的报道很多[6，14]，主要原因可能是由于硒能保护细胞免受羟基自由基的攻击，起到管理植物抗氧化酶系统的作用[15].

植物的光合作用为植物生长提供能量.光合参数能直接反应柴油对三叶草的胁迫程度.在外界环境胁迫下，植物的光合作用也会受到影响.Ahammed[16]曾对5种植物在多环芳烃胁迫下光合作用变化做了研究，研究发现，菲的质量分数显著抑制了植物的光合作用.在柴油胁迫下，造成植物光合作用的减弱的因素分为气孔因素和非气孔因素.研究指出，若随着Pn的降低，Ci也降低，则属于气孔因素；若Ci随着Pn的降低而增加则属于非气孔因素[17].在本试验中，Ci随着Pn的降低呈现升高的趋势，因此三叶草光合作用减弱的原因在于非气孔因素.高质量分数柴油胁迫下，植物体内产生大量的羟基自由基，羟基自由基的累积对植物细胞内的光合组织造成了不可逆伤害，使得叶肉细胞中的气孔扩散阻力增强，植物组织细胞活性降低，非气孔限制因素成为抑制植物光合效率的只要因素.Chaves[18]发现Gs的下降可能起到保护细胞作用，而硒在调控植物细胞气孔方面扮演着重要的角色[19].植物根系在柴油作用下限制了根从土壤中吸收水分的能力，于是叶片气孔只能关闭以减少植物体内水分的散失来维持植物正常生长，从而降低了植物的蒸腾速率[20].当气孔关闭时，植物胞间二氧化碳质量分数也就减少，植物光合所需的原料减少直接导致植物光合作用受到抑制.

叶绿素荧光参数常被用于描述植物光合作用过程以及光合生理状况，能反映环境复植物光合作用的影响[21].PSII的功能受外界环境胁迫的影响很大，而影响程度的高低可以通过叶绿素光合荧光参数的变化来反映.有研究指出最大光化学效率Fv/Fm在植物正常良好生长时维持在一个稳定值，当植物收到胁迫时，Fv/Fm会下降[22].这与本试验结论一致.ФPSⅡ的减少预示着PSII开放反应中心开放程度(qP)减弱[23].非光化学淬火(qN)通过将多余的光能转化为热能来保护外界环境胁迫下的植物光合组织结构.qN 的增加表明受到了来自外界的胁迫[24].在本次研究中，Fv/Fm、ФPSⅡ和qP的减少，以及qN 的增加，都是三叶草针对不同质量分数梯度柴油胁迫的反映.然而，硒的存在减少了Ci、qN 和增强的Fv/Fm、ФPSⅡ、qP、Pn、Tr和Gs，可能是由于硒保护植物重要的光合结构-叶绿素，提高了光合能力，并增强了对各种环境胁迫的抵抗力.

综上所述，柴油胁迫会导致植物体内产生大量的羟基自由基，大量的羟基自由基供给植物叶肉细胞以及破坏叶绿素，导致三叶草的光合荧光特性受到了抑制，使植物的生长受到抑制.而向土壤施加低质量分数的硒，能在植物体内合成硒蛋白，保护叶肉细胞抵御羟基自由基的供给，从而增加了三叶草对柴油的耐受性，改善了三叶草光合荧光受抑制的状况，从而促进了三叶草的生长.本研究为丰富和补充土壤中石油烃污染的植物修复技术提供支持.