不同产地川佛手中8种化学成分的分析与评价

崔广林，李隆云*，谭 均，张 应

1重庆市中药研究院；2 重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心；3中国中医科学院中药资源中心重庆分中心，重庆 400065

佛手是芸香科柑橘属植物佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingler)的干燥果实，按其产地主要分为川佛手、广佛手和浙佛手，具有舒肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的功效，用于治疗肝胃气滞，胸胁胀痛，胃脘痞满，食少呕吐，咳嗽痰多等病症[1]。川佛手主要分布在四川盆地边缘地区，主产于四川合江 、宜宾、沐川 、犍为、乐山及重庆等地[2]。佛手含香豆素、黄酮和酚酸等活性成分[3]，其中香豆素类化合物包括6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素等，具有抗菌、抗肿瘤、平滑肌松弛、抗凝血和光敏等作用[4]。黄酮类成分中，橙皮苷具有抗氧化、抗炎等药理活性[5]，《中国药典》(2015版)将其作为药材质量控制的主要指标成分；槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗纤维化和抗炎等作用[6]；木犀草素是一种天然黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、消和保护神经系统等作用[7]。酚酸类成分中，阿魏酸具有很强的抗氧化和抗炎活性[8]。目前，人们对佛手化学成分进行了一些研究[9-18]，但多集中在广佛手和金佛手，且涉及指标较少。佛手药材现行质量标准较为简单，仅以单一成分橙皮苷为佛手药材的质量评价，难以全面反映药材真实品质。且川佛手的产地广泛，在不同生长环境和地理位置，可能导致其质量良莠不齐，成分有差异。为了更好的综合比较、评价不同产地川佛手的质量，本实验首次以木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸8种成分为指标，进行主成分分析和聚类分析，探讨不同产地川佛手药材的质量差异，旨在为制定川佛手药材的质量标准提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20 AT 型HPLC(包括DGU-20 A5检测器、LC-20 AT泵、SIL-20 A自动进样器、SPD-M20 A二极管氘灯、CTO-20 A柱温箱)(日本岛津公司)，BS223 S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，GZX-GF型电热恒温鼓风干燥箱(上海龙跃仪器设备有限公司)；KQ(250DB型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品木犀草素(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST(14120224，纯度≥99%)、6,7-二甲氧基香豆素(上海源叶生物有限公司，批号15011524，纯度≥98%)、莨菪亭(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-14081804，纯度≥98%)、5,7-二甲氧基香豆素(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-14070501，纯度≥99%)、7-羟基香豆素(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-14120715，纯度≥98%)、橙皮苷(上海源叶生物有限公司，批号14092432，纯度≥97%)、槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST(14082610，纯度≥98%)、阿魏酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-14012214，纯度≥99%)冰醋酸和甲醇为色谱纯(TEDIA公司)，其余试剂为分析纯，水为纯净水。

1.3 样品

试验所用药材样品2015年采自川佛手主产区重庆和四川，共48份，采集地信息见表1。每个采样点随机选择 10 株无明显病虫害的佛手植株，采集成熟果实后混匀，洗净表面的杂质，晾干，再切成薄片，置于电热恒温鼓风干燥箱中，50 ℃烘干打粉，过 60 目筛备用。全部样品均由重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定，为芸香科柑橘属植物佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingler 的果实。

表1 川佛手样品来源

续表1(Continued Tab.1)

样品号Sample No.产地Areas样品号Sample No.产地Areas12重庆市江津区石塻镇36四川省石棉县天湾乡幸福村13四川省合江县白鹿镇37四川省泸定县得妥乡14四川省合江县石龙镇38四川省汉源县洪福乡15四川省安岳县龙台镇龙西村39四川省荥经县新添乡16四川省安岳县天马乡40四川省德阳市中江县太平乡17四川省合川县草街镇41四川省绵阳安县花该镇18四川省宜宾市宜宾县蕨溪镇42四川省南充南部县永红乡19四川省宜宾市宜宾县蕨溪镇大坪村43四川省南充市顺庆区灯台乡20四川省宜宾市宜宾县蕨溪镇正华村44重庆市云阳县养鹿新合村21四川省宜宾市宜宾县蕨溪镇石坪村45重庆市云阳县龙角镇22四川省宜宾市宜宾县蕨溪镇后坝村46重庆市云阳县养鹿同发村23四川省宜宾市屏山县屏山镇金象村47重庆市云阳县养鹿桐林村24四川省宜宾市屏山县富荣镇撕栗村48重庆市云阳县养鹿中山村

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，流动相为0.2%冰醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～5 min，90% A；5～10 min，90%～75% A；10～18 min，75% A；18～30 min，75%～70% A；30～40 min，70%～60% A；40～60 min，60%～30% A； 90% A，保持5 min)，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长322 nm。色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)与样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards ( A) and sample ( B)注：1.7-羟基香豆素 2.莨菪亭 3.阿魏酸 4.6,7-二甲氧基香豆素 5.橙皮苷 6.槲皮素 7.5,7-二甲氧基香豆素 8.木犀草素。Note:1.7-hydroxy coumarin 2.Scopoletin 3.Ferulic acid 4.6,7-dimethoxy coumarin 5.Hesperidin 6.Quercetin 7.5,7-dimethoxy coumarin 8.Luteolin.

2.2 对照品溶液的制备

精密称取木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸对照品各3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，静置，得质量浓度为0.3 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取佛手粉末(过100目筛)约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量；静置1 h，超声提取40 min，冷却，称定质量，用甲醇补足减失的质量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

2.4 线性关系的考察

精密吸取2.2项下木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸对照品溶液各1 mL，置于10加容量瓶中，定容至刻度，混匀，静置，制样。分别以4、8、12、16、20 μL按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积为Y纵坐标，对照品含量X为横坐标进行线性回归，各被测成分回归方程和线性范围见表2。结果表明，8种成分在一定质量浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸峰面积的RSD分别为4.526%、2.946%、1.971%、2.455%、0.805%、3.728%、1.10%、1.321%，表明精密度较好。

表2 川佛手中8种成分的线性关系考察

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于 2、4、6、8、12 h按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸的峰面积的RSD分别为4.514%、1.161%、2.148%、4.148%、0.941%、4.921%、1.303%、2.098%，说明供试品在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

称取佛手粉末约0.5 g，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果木犀草素、6,7-二甲氧基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、橙皮苷、槲皮素、阿魏酸含量的RSD分别为4.088%、3.048%、1.915%、4.427%、1.525%、4.936%、3.074%、3.103%，说明方法重复性好。

2.8 加样回收率试验

精密称取35号佛手样品6份，每份约0.5 g，精密称取7-羟基香豆素、莨菪亭、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素、木犀草素分别为4、2、1.6、1.0、13.2、3.5、27.5、8.5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，加入混合标准品溶液1mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，计算各成分的平均加样回收率，结果见表3，表明本方法的回收率良好。

表3 加样回收率试验结果

续表3(Continued Tab.3)

成分Component样品中含量Original amount ( mg)加入量Added amount (mg)测得量Detected amount回收率Recovery平均回收率Average recoveryRSD莨菪亭Scopoletin0.20.20 0.38 92.4791.222.120.210.20 0.39 90.870.20.20 0.38 87.850.190.20 0.37 90.560.20.20 0.38 92.410.20.20 0.39 93.15阿魏酸Ferulic acid0.160.16 0.30 90.2193.294.910.170.16 0.32 94.130.160.16 0.32 101.250.160.16 0.31 90.870.170.16 0.32 94.790.160.16 0.30 88.496,7-二甲氧基香豆素6,7-Dimethoxy coumarin0.10.10 0.20 96.5196.523.310.110.10 0.21 98.140.10.10 0.19 93.480.10.10 0.19 92.760.10.10 0.20 101.510.10.10 0.20 96.72橙皮苷Hesperidin1.321.32 2.59 96.5493.532.661.331.32 2.55 92.781.321.32 2.59 96.421.311.32 2.51 90.761.321.32 2.55 93.461.321.32 2.52 91.22槲皮素Quercetin0.350.35 0.69 96.6693.122.310.360.35 0.69 95.20.350.35 0.69 97.410.350.35 0.65 86.740.350.35 0.66 89.540.350.35 0.68 93.155,7-二甲氧基香豆素5,7- Dimethoxy coumarin2.752.75 5.40 96.5196.364.522.752.755.38 95.742.752.755.45 98.142.752.755.32 93.482.752.755.30 92.762.752.755.54 101.51木犀草素 Luteolin0.850.85 1.65 94.5293.082.280.860.85 1.65 93.130.850.85 1.62 90.750.850.85 1.67 96.420.850.85 1.63 91.210.850.851.64 92.45

2.9 样品含量测定

按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定不同产地川佛手样品中7-羟基香豆素、莨菪亭、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素、木犀草素的含量。试验结果表明，48批来自不同产地的川佛手药材中8 种有效成分的含量存在差异，其中5,7-二甲氧基香豆素和橙皮苷在样品中含量较高，6,7-二甲氧基香豆素在样品中含量较低。具体如表4所示。

表4 48个产地川佛手中8种成分含量测定结果(mg/g, n=3)

续表4(Continued Tab.5)

样品号Sample No.7-羟基香豆素7-hydroxy coumarin莨菪亭Scopoletin阿魏酸Ferulic acid6,7-二甲氧基香豆素6,7-Dimethoxy coumarin橙皮苷Hesperidin槲皮素Quercetin5,7-二甲氧基香豆素5,7-Dimethoxy coumarin木犀草素Luteolin350.680.350.560.399.250.705.790.36360.760.130.230.152.900.424.550.56370.400.110.100.141.530.172.040.86380.460.290.570.091.990.504.250.37390.680.060.330.193.140.6411.030.64400.270.080.420.091.640.170.610.49410.440.130.850.132.500.493.960.44421.350.180.240.407.570.5313.280.55430.450.150.270.264.280.367.580.47440.240.120.250.041.120.220.700.58450.870.230.200.256.070.276.000.51460.830.240.190.286.440.295.590.64470.440.140.110.112.020.185.910.98480.550.150.110.131.940.296.730.60

2.10 川佛手中8种化学成分之间相关性分析

以川佛手样品中 8 化学成分的含量为数据，组建数据矩阵，采用 DPS v16.05数据处理系统对数据进行相关性分析，结果见表5。结果表明：7-羟基香豆素与6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素；阿魏酸与6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素；6,7-二甲氧基香豆素与橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素；橙皮苷与槲皮素；槲皮素与5,7-二甲氧基香豆素呈极显著正相关，橙皮苷与木犀草素呈极显著负相关，7-羟基香豆素与阿魏酸呈显著正相关，木犀草素与7-羟基香豆素、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、槲皮素呈显著负相关，化学成分间相关性较强，表明此类化学成分可能在川佛手生长过程中存在内在的相关关系。

表5 相关性分析结果

注：*P<0.05，变量相关关系显著；**P<0.01，变量相关关系极显著(均为双侧检验)。

Note:*P<0.05,significant correlation;**P<0.01,extremely significant correlation．

2.11 同产地川佛手品质的主成分分析

2.11.1 主成分分析

以48份川佛手药材的8种化学成分检测结果为基础，通过DPS v16.05数据处理系统，采用主成分分析法得到各个主成分的特征值、方差贡献率、 累计方差贡献率及对应的特征向量(表6)。其中特征值表示了对应主成分能够描述原有信息的多少，由表6可知主成1和主成分2特征值均大于1，其中第1主成分的方差贡献率为49.53%，第2主成分的方差贡献率为15.59%，累计方差贡献率达65.12 %，具有较强的信息代表性，因此，提取前2个主成分代替原8个成分指标评价川佛手药材的品质，以达到降维的目的。决定第一主成分大小的主要是6,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、槲皮素和橙皮苷4个性状分量，其中6,7-二甲氧基香豆素特征向量达0.447，是佛手药材质量分级的最主要指标。决定第二主成分大小的主要是木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素。由此可以看出，6,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、槲皮素、橙皮苷、木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素6种成分是川佛手的特征成分。

表6 8个主成分的特征向量、特征值、贡献率及累积贡献率

2.11.2 不同产地川佛手品质的综合评价

以特征向量为权重构建2个主成分的表达函数式：

F1=0.443X1+0.180X2+0.341X3+0.447X4+0.390X5+0.416X6+0.278X7-0.230X8

F2=0.053X1-0.082X2+0.059X3+0.001X4-0.232X5+0.089X6+0.663X7+0.697X8

2个表达式中，X1为7-羟基香豆素、X2为莨菪亭、X3为阿魏酸、X4为6,7-二甲氧基香豆素、X5为橙皮苷、X6为槲皮素、X7为5,7-二甲氧基香豆素、X8为木犀草素。

以各个主成分对应的方差贡献率作为权重，由主成分得分和对应的权重线性加权求和得到综合评价函数。

F= 0.495Z1+0.156Z2

根据主成分综合得分模型，可计算出48个产地川佛手的综合得分值和排序结果(表7)。综合排序的名次越前，表明就该 8 项指标而言，该样品的质量较好，反之，质量就较差。四川省宜宾市长宁县老翁镇(26号)佛手样品综合得分最高，药材质量最优，其次为四川省乐山市犍为县新民镇(32号)佛手样品，重庆市云阳县养鹿新合村(44号)佛手样品综合得分最低，药材质量最差。

表7 主成分得分、综合得分及排序

续表7(Continued Tab.7)

样品号Sample No.F1F2综合得分FComprehensive F排序Sorting390.03640.42680.0851640-2.0861-1.3845-1.2494641-0.2245-1.0456-0.27426422.5872-0.09621.266743-0.1942-0.8756-0.2332444-2.4986-1.1005-1.40848450.5011-1.17860.06418460.4887-0.87080.1061547-2.17750.6647-0.9744448-1.3431-0.3714-0.72336

2.12 不同产地佛手化学成分的聚类分析

聚类分析是将样品按照品质特性相似程度逐渐聚合在一起， 相似度最大的优先聚合在一起，最终按照类别的综合性质多个品种聚合，从而完成聚类分析的过程[19]。而系统聚类则是把相似的样品或变量归类的有效方法。因此，本实验使用 SPSS Statistics 20对不同产地川佛手中7-羟基香豆素、莨菪亭、阿魏酸、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素、木犀草素的含量测定结果进行系统聚类，以8种有效成分含量为聚类的变量，采用平方欧氏距离(squared Euclidean distance)获得聚类分析树状图，结果见图2。由图2可知，当阈值为10时，48个不同产地川佛手样品被聚为3类，其中1、47、3、48、6、33、34、38、41、36、17、40、44、13、37、16、43、27、20、30、45、46、5、19、8、15、9、11、14、18、23、31、39、28聚为一类，该类样品主要产自四川大部分地区及重庆市云阳县，样品特征为各化学成分含量较平均；29(四川省乐山市沐川县新凡乡)、35(四川省石棉县田湾乡)聚为一类，该类特征为橙皮苷含量较高；25、26、7、24、32、22、42、21、4、10、2、12聚为一类，该类样品主要产自四川省宜宾市及重庆少部分地区，样品特征为5,7-二甲氧基香豆素和木犀草素含量较高。

3 讨论

佛手为2015年版中国药典收载品种，其含量测定项下以橙皮苷含量为考察指标。本研究采集了48个川佛手产区的药材样品，采用HPLC技术同时测定了7-羟基香豆素、莨菪亭、5,7-二甲氧基香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、槲皮素、橙皮苷、阿魏酸和木犀草素共8个化学成分指标，该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于川佛手药材中8种成分含量的同时测定，可以为全面评价川佛手药材的质量提供一种切实可行的参考根据。在实验中，通过全波长扫描(190～400 nm)确定了8种待测成分在322 nm处均有最大吸收。在最大波长下测定，提高了检测的灵敏度，另外，在同一波长条件下完成川佛手中8种成分的含量测定，方法快捷。

图2 48批川佛手样品的聚类树状图Fig.2 Results of dendrogram from 48 batches Fructus Citris Sarcodactylis

相关性分析旨在研究2个变量之间的变化趋势，本研究对川佛手药材中的 8 个成分进行了相关性分析，由相关性分析结果可知，7-羟基香豆素、6,7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、槲皮素、5,7-二甲氧基香豆素和阿魏酸之间显著正相关，表明此类化学成分可能在川佛手生长过程中存在内在的相关关系。

主成分分析是一种多指标的综合评价方法， 旨在利用降维的思想把多指标转化为少数几个综合指标，现已广泛用于中药研究领域[20]。本研究以48份川佛手药材的8种化学成分检测结果为基础，采用主成分分析法得到2个主成分因子。决定第一主成分大小的主要是6,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、槲皮素和橙皮苷4个性状分量，其中6,7-二甲氧基香豆素是佛手药材质量分级的最主要指标。决定第二主成分大小的主要是木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素。因此，建议使用6,7-二甲氧基香豆素、7-羟基香豆素、槲皮素、橙皮苷、木犀草素和5,7-二甲氧基香豆素6个指标作为川佛手质量标准的评价指标，从而进一步弥补其药典中单一橙皮苷成分进行质量检测的不足。

本研究结果显示，48份药材样品的橙皮苷含量都达到0.003%的《中国药典》标准。不同产地川佛手药材具有一定的差异性，其中5,7-二甲氧基香豆素和橙皮苷在样品中含量较高，6,7-二甲氧基香豆素在样品中含量较低。7-羟基香豆素含量最高的为四川省宜宾市长宁县老翁镇(26号样品)；莨菪亭含量最高为四川省乐山市沐川县高笋乡(27号样品)；阿魏酸含量最高为四川省乐山市犍为县新民镇(32号样品)；6,7-二甲氧基香豆素含量最高为四川省宜宾市长宁县老翁镇(26号样品)；橙皮苷含量最高为四川省石棉县田湾乡(35号样品)；槲皮素含量最高为四川省宜宾市宜宾县蕨溪镇石坪村(21号样品)；5,7-二甲氧基香豆素含量最高为四川省乐山市犍为县新民镇(32号样品)；木犀草素含量最高为重庆市万州区甘宁镇(2号样品)。

聚类分析是一种可将一组数据按照本身内在的规律较合理地分为几类的探索性的分类方法，此方法可以大大缩小了以往全凭主观判断所造成的误差，使数据分析结果客观性更强[21]。本文以 8种化学成分的含量为指标对48个不同产地的川佛手样品进行聚类分析，聚类分析结果将不同产地分为3类：29(四川省乐山市沐川县新凡乡)、35(四川省石棉县田湾乡)归为一类，该类特征为橙皮苷含量较高；25、26、7、24、32、22、42、21、4、10、2、12归为一类，该类样品主要产自四川省宜宾市及重庆少部分地区，样品特征为5,7-二甲氧基香豆素和木犀草素含量较高；其余产地归为第三类，该类样品主要产自四川大部分地区及重庆市云阳县，样品特征为各化学成分含量较平均。