5株酿酒酵母对海棠果酒品质的影响

刘灿珍，侯冬冬，刘 文，孙玉霞，秦伟帅，赵新节*

（1.齐鲁工业大学 山东省微生物工程实验室，山东 济南250353；2.山东省农业科学院，山东 济南250100；3.泰山学院 生物与酿酒工程学院，山东 泰安271000）

海棠果果实偏小，甜味中稍带酸味和涩味，含有丰富的有机酸、微量元素、维生素、多酚复合物等，黄酮类物质是多酚复合物中的主要成分，具有很高的抗氧化活性[1]。在氧化条件下，脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白质、脂类等物质会受到破坏，而酚类物质可阻挡自由基，破坏自由基链式反应，调节生物体生理功能[2-3]，但因海棠果的品种及生长环境不同，酚类物质的含量也不同[4]。

果实发酵酒的化学成分与挥发性成分不仅来源于果实本身，还包括酵母菌的代谢[5]。酵母在酒精发酵过程中产生大量的发酵副产物，包括高级醇、脂肪酸、乙酸酯、乙基酯、醛、有机酸等，是发酵酒的重要香气成分并显著影响发酵酒的感官和品质[6]。酵母菌对芳香族化合物和果香水平的影响占主导地位，不同的酵母菌种发酵同种葡萄汁产生的香气成分明显不同，这是由于酵母的代谢活性、合成酶和分解酶活性不同，导致释放和合成多种挥发性复合物的能力不同[7-8]。目前对海棠果的研究有海棠果果实营养物质方面，包括对海棠果的果皮、果肉、种子的酚类物质进行探究[9]，以及在产品开发方面，将海棠果加工为果条、果酱等[4]。在发酵海棠果果酒方面以及利用不同酿酒酵母发酵海棠果酒方面还需要进一步研究，因此，通过对不同酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵海棠果果酒的活性成分及香气物质进行分析鉴定，并筛选出适合酿造海棠果果酒的酿酒酵母具有重要意义。

本研究利用5株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RC212、TOP15、71B、DV10、CY3079分别发酵海棠果制备海棠果酒，对5株酿酒酵母发酵的海棠果酒的基本理化指标、生物活性成分的含量及挥发性香气成分的种类与含量进行分析，以便于选择适合发酵海棠果果酒的酿酒酵母，为海棠果发酵酒的生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

垂丝海棠果（总糖135 g/L、还原糖112.5 g/L、总酸15.45 g/L、pH值3.74、可溶性固形物16%）：临沂市河东区。

ROHAVIN果胶酶（50 000 U/g）：上海鼎唐国际贸易有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RC212、TOP15、71B、DV10、CY3079：上海杰兔工贸有限公司；没食子酸、儿茶素、香草醛、芦丁（纯度均≥98%）、福林酚（1 mol/L）：索莱宝生物有限公司；偏重亚硫酸钾、菲林试剂（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SPL-250生化培养箱：天津莱玻特瑞仪器设备有限公司；DLSB-5L/25低温冷却液循环泵：巩义市予华仪器有限责任公司；TQ8050自动固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、7890B气相色谱-5977A型质谱（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 海棠果酒的制备工艺及操作要点

海棠果→果粒分选→破碎打浆→调整硫含量→添加果胶酶→调整糖含量→分别接种5株酿酒酵母→发酵（22 ℃）→发酵结束→皮渣分离→添加偏重亚硫酸钾，调整硫含量→低温澄清→海棠果酒

操作要点：

（1）偏重亚硫酸钾添加量均为120 mg/L，果胶酶添加量为50 mg/L，总糖含量为210 g/L，酵母添加量为300 mg/L。

（2）酵母活化：按酵母与水的质量体积比为1∶10将酵母接种于含有5%的糖水中，37 ℃温和搅拌活化30 min，再逐渐添加海棠果汁温和搅拌活化15 min。

（3）发酵过程中每天进行搅拌。

分别在发酵第1、3、5、7、10、13、18天取样、离心。

1.3.2 海棠果酒基本理化指标分析

残糖、pH值、总酸、挥发酸、酒精度的测定参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；还原糖的测定采用斐林试剂法。

1.3.3 海棠果酒活性成分分析

总酚含量测定采用福林酚法[10]；单宁含量测定采用盐酸-香草醛法[11]；总黄酮含量测定采用分光光度法[12]。

1.3.4 海棠果酒香气成分分析

固相微萃取：取发酵结束后的海棠果酒8 mL于20 mL顶空瓶中，同时加入2 g NaCl及20 μL质量浓度为2 g/L的内标4-甲基-2-戊醇。升温到45 ℃时，用DVB/CAR/PDMS萃取头萃取50 min，解吸10 min，进样分析。

气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30m×0.25 mm×0.25 μm）。梯度升温程序为初始值40 ℃，保持2 min；1 ℃/min升温至45 ℃，保持2 min；3 ℃/min升温至84 ℃，保持2 min；3 ℃/min升温至120 ℃，保持3 min；3 ℃升温至200 ℃；5 ℃升温至230 ℃。载气为氦气（He）；流速为1.221 mL/min，不分流。

质谱条件：离子源为电子电离（electron ionization，EI）源；进样口温度250 ℃；检测器温度250 ℃；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；全扫描模式，质量扫描范围为30～400 m/z[13]。

2 结果与分析

2.1 5 株酿酒酵母对海棠果酒基本理化指标的影响

5株酿酒酵母发酵海棠果结束后，海棠果酒的基本理化指标见表1。

表1 5株酿酒酵母发酵的海棠果酒的理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

由表1可知，在5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中，残糖量均＞10 g/L，酒精度均＞10%vol。其中，酵母菌CY3079发酵的海棠果酒的残糖量（14.20 g/L）最低，酒精度（13.00%vol）最高，其次是酵母菌DV10。5株酿酒酵母发酵的海棠果酒的残糖量均＞10 g/L的原因可能是在发酵中未补充可同化氮源，限制了氮源代谢，使酵母生长繁殖需要的蛋白合成前体物合成受阻，从而使发酵终止[14]；也可能是果胶酶分解果胶等物质产生酵母难以利用的还原糖，从而使残糖量较高[16]。海棠果酒较海棠果汁本身的pH值（3.74）均升高，除酵母菌TOP15与DV10外，总酸含量均高于原料海棠果（15.45 g/L），说明酵母菌TOP15与DV10具有一定降酸能力，但发酵后的总酸含量均＞14.0 g/L，超出国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求（8.0 g/L）[15]，因此，在酿造过程中需要进行降酸处理。另外，挥发酸物质含量（0.23～0.56 g/L）均＜1.2 g/L，符合果酒相关标准[15]。

2.2 5株酿酒酵母对海棠果酒生物活性成分的影响

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中还原糖含量变化趋势如图1所示。

图1 5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中还原糖含量变化趋势Fig. 1 Change trend of reducing sugar content in crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

由图1可知，除酵母菌RC212与TOP15外，其余3株酿酒酵母在发酵过程中，海棠果酒中还原糖含量均呈现先升高后降低的趋势，这是由于在发酵前期，酵母菌将不能利用的非还原性物质（果胶等）转化为还原糖，使前3天发酵液中的还原糖含量升高；随后酵母菌利用还原糖进行酒精发酵，因此还原糖含量下降[16]，且在发酵5～7 d间的还原糖消耗量最大，均＞100 g/L，发酵速率最快；发酵10 d后，还原糖含量基本保持不变，其中酵母菌RC212发酵速率最快，除TOP15酵母外，其余酿酒酵母菌均具有良好的发酵性能。

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中生物活性成分含量测定结果见表2。

表2 5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中生物活性成分含量Table 2 Bioactive components contents in crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

由表2可知，酵母菌71B、RC212发酵的海棠果酒中总酚含量相对其他3株酵母菌较高，分别为1.67 g/L、1.62 g/L，其他酵母菌发酵的海棠果酒中总酚含量在1.35～1.47 g/L。同时，酵母菌71B与RC212发酵的海棠果酒中单宁含量也相对较高，分别为0.78 g/L、0.71 g/L。酵母菌RC212发酵的海棠果酒中黄酮含量最高，酵母菌CY3079次之。总体来说，酵母菌71B与RC212发酵的海棠果酒中生物活性成分含量较高，酵母菌TOP15与DV10发酵的海棠果酒中生物活性成分含量较低。除酒精度影响酚类物质含量外，发酵过程中酵母细胞壁吸附酚类物质[17]、单宁与蛋白质、多糖等大分子物质结合成不溶性的沉淀[18]、酵母的次级代谢物丙酮酸、乙醛等与多酚类物质反应生成大分子聚合物、微生物产生的酶降解多酚类物质导致其水溶性下降产生沉淀[19]等均会对酚类物质的含量产生影响。

2.3 5 株酿酒酵母发酵海棠果酒香气成分分析

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中香气成分的种类和含量测定结果见表3。

表3 5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中香气成分的种类及含量Table 3 Types and contents of aroma components in crab apple wines fermented by 5 strains of Saccharomyces cerevisiae

续表

续表

由表3可知，通过GC-MS从5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中共检测到62种挥发性物质，包括29种酯类、13种醇类、8种酸类、5种醛酮类、5种萜烯类和2种其他类物质。酵母菌71B发酵的海棠果酒中挥发性物质总含量最高，为267.02mg/L，其次为酵母菌RC212（228.56 mg/L），酵母菌CY3079发酵的海棠果酒中挥发性物质的总含量为177.20 mg/L，稍低于酵母菌DV10（191.01 mg/L），酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中挥发性物质的总含量最低，为102.90 mg/L。

2.3.1 酯类物质

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中酯类物质的总含量存在明显差异（P＜0.05），其中酵母菌RC212发酵的海棠果酒中酯类物质含量最高，为114.43 mg/L。其次为酵母菌71B与CY3079，分别为78.26 mg/L、77.91 mg/L，海棠果酒中酯类含量相近。酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中酯类物质含量为68.07 mg/L。酵母菌DV10发酵的海棠果酒中酯类物质含量最低，为54.02 mg/L。

酵母菌RC212与酵母菌71B发酵的海棠果酒中均检测到23种酯类物质，酵母菌CY3079与TOP15发酵的海棠果酒中均检测到22种酯类物质，但酵母菌DV10发酵的海棠果酒中的酯种类最少（17种）。5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中共检测到6种乙酸酯，乙酸酯中乙酸乙酯的含量均＜100 mg/L，其中酵母菌RC212最高，赋予海棠果酒愉人的果香气味。乙酸异戊酯为海棠果酒提供香蕉香气，5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中乙酸异戊酯含量均＞其阈值（0.2 mg/L）[13]，且在酵母菌RC212发酵的海棠果酒中含量较高，为22.19 mg/L，是其他4种酿酒酵母发酵的海棠果酒的10倍。海棠果酒中还检测到8种乙基酯，其中己酸乙酯（香蕉、菠萝、苹果香气）、辛酸乙酯（玫瑰、橙子香气）、癸酸乙酯（果香、花香）、月桂酸乙酯（月桂油香气）是发酵酒中的主要乙基酯类物质[13]。酵母菌RC212发酵的海棠果酒在上述4种乙基酯中的含量均最高。丁二酸二乙酯提供果香及瓜香[20]，在酵母菌CY3079发酵的海棠果酒中含量最高，为0.52 mg/L，但在酵母菌DV10发酵的海棠果酒中未检测到。乙酸异丁酯、甲酸乙酯、正辛酸异丁酯仅在酵母菌RC212发酵的海棠果酒中检测到，甲酸辛酯、苯甲酸甲酯仅在酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中检测到，4-羟基丁酸内酯仅在酵母菌71B发酵的海棠果酒中检测到。

2.3.2 醇类物质

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中共检测出13种醇类物质，其中多数属于高级醇。

酵母菌71B发酵的海棠果酒中总醇含量最高，为167.89 mg/L，酵母菌CY3079与DV10发酵的海棠果酒中总醇含量次之，分别为152.78mg/L、157.37mg/L，酵母菌RC212发酵的海棠果酒中总醇含量为94.45 mg/L，酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中总醇含量最低，为78.89 mg/L。5种酿酒酵母发酵的海棠果酒中高级醇总量均＜400 mg/L，可增加发酵酒香气的复杂性。异丁醇（溶剂、酒精、生青味）、异戊醇（果香、指甲油气味）、己醇（生青味）、苯乙醇（茉莉、玫瑰花香）是发酵酒中主要的醇类物质[13]，其中异戊醇是海棠果酒中含量最高的醇类物质，均＞其阈值（14.5 mg/L），除酵母菌TOP15发酵的海棠果酒外，其余4株酿酒酵母发酵的海棠果酒中异戊醇含量均占高级醇总量的61%以上，酵母菌71B发酵的海棠果酒中异戊醇含量最高，为103.91 mg/L，是酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中异戊醇含量（43.59 mg/L）的2.3倍，是酵母菌CY3079（88.37 mg/L）、DV10（86.28 mg/L）

发酵的海棠果酒的1.2倍。苯乙醇也是高级醇中比重较大的醇，除酵母菌RC212（7.58 mg/L）、TOP15（8.80 mg/L）外，其余3株酿酒酵母发酵的海棠果酒中苯乙醇含量均＞其阈值（10.0 mg/L），是阈值的3倍多。5株酵母发酵酒的己醇含量均＞其阈值（1.1 mg/L），且酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中己醇含量最高，为8.60 mg/L，酵母菌RC212发酵的海棠果酒中己醇含量最低，为4.82 mg/L。

2.3.3 酸类物质

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中共检出8种酸类物质，主要包括乙酸（醋酸味）、新癸酸（脂肪香、奶香）、辛酸（腐臭、奶酪、脂肪酸）、苯甲酸（苯味）[22]，均未检测到己酸。

酵母菌DV10发酵的海棠果中总酸含量最高，其中乙酸含量也最高，为3.50mg/L，其次为酵母菌CY3079（2.94mg/L），乙酸含量最低的是酵母菌RC212（1.58 mg/L）。酵母菌RC212发酵的海棠果酒中辛酸、癸酸含量均最高，酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中苯甲酸含量最高。乙酸是发酵酒中主要的挥发酸，可与醇反应生成有水果香的醋酸酯，醋酸含量过高时，说明发酵酒被醋酸菌、乳酸菌污染，超过阈值200 mg/L时，发酵酒带有酸味。由于5株酵母发酵的海棠果酒中酸含量均较低，因此不会给发酵酒带来不愉悦的香气。

2.3.4 其他类

5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中检出的挥发性香气物质除酯类、醇类、酸类外，还包括醛酮类、萜烯类、挥发性酚类物质等。乙醛是发酵酒中主要的羰基化合物，具有青苹果和坚果的香气，也是葡萄酒氧化的标志，当红葡萄酒中乙醛含量＜100 mg/L时，赋予葡萄酒香气复杂性，乙醛仅在酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中检测到。α-紫罗酮具有覆盆子香气[13]，在酵母菌RC212发酵的海棠果酒中的含量最高（0.83 mg/L），是其他3株酵母71B、CY3079、DV10发酵的海棠果酒的2倍，同时苯甲醛含量（杏仁香气）也最高。萜烯类物质主要来源于果实本身，其含量在发酵酒香气成分中的比重较小，酵母菌DV10发酵的海棠果酒中萜烯类物质含量最高（14.76 mg/L），在检出的5种萜烯类物质中，芳樟醇（铃兰香气）的含量最高，为13.63 mg/L。2,4-二叔丁基苯酚在5株酵母发酵的海棠果酒中均被检出，且在酵母菌CY3079发酵的海棠果酒中的含量最高（11.80 mg/L）。

3 结论

分别采用5株酿酒酵母发酵海棠果，获得5种海棠果酒，对5种海棠果酒的基本理化指标、生物活性成分及香气成分进行分析。结果表明，在5株酿酒酵母发酵的海棠果酒中，除残糖量偏高外，其他均达到发酵酒的标准。酵母菌71B发酵的海棠果酒中总酚、单宁含量最高，黄酮含量居中。通过气质（GC-MS）联用法共检测到62种挥发性物质，5种海棠果酒中共有挥发性物质为34种，主要香气成分包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、异戊醇、苯乙醇。不同酵母发酵的海棠果酒的香气成分存在差异。酵母菌RC212发酵酒的酯类物质含量最高；酵母菌71B发酵的海棠果酒中醇类物质含量最高；酵母菌DV10发酵的海棠果酒中酸类、萜烯类物质含量最高；酵母菌TOP15发酵的海棠果酒中醛酮类物质含量最高，但醇类物质含量最低。本研究为实践中发酵海棠果酒挑选满足特定需要的酵母提供理论基础。