追施氮肥对灌浆期沙地饲用燕麦叶片衰老特性的影响

张玉霞，朱爱民,3，郭 园，杜晓艳，栾瑞涛

(1.内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028041；2.通辽市星圣农业公司，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018)

燕麦(Avenasativa)属禾本科燕麦属植物，具有耐寒、抗逆性强、适口性好、易于栽培、产量高等优点，是一种重要的牧草、饲料和粮食兼用作物[1-2]。近年来在甘肃、内蒙古等地区以喷灌沙地苜蓿为主的草产业发展迅猛[3]，燕麦草作为苜蓿倒茬轮作的首选牧草种类，种植规模也在不断扩大，在中国草产业发展中具有重要地位[4]。吴浩[5]、马力[6]、刘华[7]、马祥[8]、王乐[9]等对燕麦高产施肥进行过深入研究，但针对氮素对燕麦衰老特性的研究较少。

植物衰老是指植物的一个器官或植株整个生命功能衰退的一系列变化过程，并最终导致植物自然死亡[10]。植物衰老现象表现为植物生长速度减慢、植物整体活力下降、不适应周围环境的改变、抗病抗虫能力减弱等。Roca[11]、Liu[12]等研究表明，植物衰老伴随着光合作用能力减弱并丧失、叶绿体解体、二氧化碳固定减弱、酶的降解等变化过程。近年来，国内学者关于植物衰老与活性氧自由基关系的研究正在不断深入[13]，较多的研究主要集中在小麦[14]、水稻[15]、玉米[16]和棉花[17]等作物上，得出叶片进入衰老时期表现在植株生理特性几个方面，叶片光合能力下降，维持叶片功能的叶绿素等含量下降，活性氧代谢紊乱失衡等。引起植物衰老的因素有很多，有内在因素，也有外在因素。施氮是增加燕麦产量的重要技术之一[18]，然而，燕麦生产过程中不合理施用氮肥造成氮肥利用率低以及氮流失、环境污染等问题[19]，不合理施用氮肥亦会造成燕麦生长受阻，影响燕麦产量和品质。蔡红梅[20]研究表明，缺氮胁迫下，植物体内氮素含量不足，氨基酸、叶绿素、蛋白质等的含量减少，植物衰老加快，光合活性降低，碳水化合物的合成受阻。叶片细胞中大部分氮素存在于叶绿体中，所以缺氮情况下，叶绿体中的含氮大分子化合物叶绿素的合成受阻，叶片出现黄化特征[21]。为此，在科尔沁沙地进行氮肥试验，通过分析氮素对沙地燕麦叶面积、叶绿素含量及保护酶活性的影响，探究不同氮素水平下饲用燕麦叶片的衰老特性机制，为沙地饲用燕麦合理种植提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

2016年3-7月，在内蒙古自治区通辽市星圣草业公司的沙化草地进行燕麦氮肥试验，试验地位于N 44°36″，E 123°22″，年平均气温为6.0～6.2 ℃，≥10 ℃年活动积温为3 100～3 200 ℃，年均日照时长为2 900～3 100 h，无霜期145～150 d，每年平均的降水在350～400 mm，年平均风速为3.8～4.5 m/s。该地区以沙土为主，pH值8.0，土壤有机质含量6.59 g/kg，碱解氮36.37 mg/kg，速效磷含量3.81 mg/kg，速效钾含量78.51 mg/kg，全氮含量370 mg/kg。

1.2 供试材料

供试燕麦品种为梦龙，来源于佰百斯特种子公司，2016年3月25日采用条播方式种植，播种量为105 kg/hm2，行距15 cm，播种深度5 cm，基肥为过磷酸钙(44%)和氯化钾(60%)各150 kg/hm2。

1.3 试验设计方案

试验区采取随机区组设计，设置了0(CK)，70，140，210，280 kg/hm2的施氮(纯氮)量，分别用N0、N70、N140、N210、N280表示，试验中用到的氮肥为尿素(氮含量为46%)，小区面积为15 m2，4次重复，共20个小区。于苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期进行人工追施氮肥，每次追施用量分别为全年用氮量的15%，40%，25%，20%。采用撒施方式施肥，施肥后马上进行喷灌。

1.4 测定指标及方法

于灌浆期取样，取各处理长势一致的燕麦功能叶片(旗叶、倒二叶、倒三叶)，迅速放入冰盒内，于实验室中测定各部位叶片叶绿素含量、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、丙二醛含量。

叶片叶绿素含量测定：将叶片剪碎混匀，用80%丙酮浸提法测定，重复3次。

叶面积测定：每个处理取10株长势一致的燕麦植株，分别取旗叶、倒二叶、倒三叶测量每个样株的长和宽。叶面积/cm2=长(cm)×宽(cm)×校正系数。

可溶性蛋白测定：考马斯亮蓝法测定[22]。

抗氧化酶测定：超氧化物歧化酶(SOD)用氮蓝四唑法测定；过氧化物酶(POD)用愈创木酚法测定；过氧化氢酶(CAT)用紫外吸收法测定。

丙二醛(MDA)测定：硫代巴比妥酸法测定[23]。

1.5 数据分析

试验数据采用Excel 2003软件和SPSS 2010软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 追施氮肥对沙地燕麦叶面积的影响

如表1所示，不同氮素水平均促进沙地燕麦功能叶叶片面积的增加。其中N210处理的燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶片面积分别是10.98,20.85,19.21 cm2，均显著高于N0，另外，N210的旗叶、N280的倒二叶均较N0增加显著，分别增加7.39,11.78 cm2。

表1 不同氮肥处理下沙地燕麦功能叶叶面积 Tab.1 Functional leaf area of sandy oat under different nitrogen treatments cm2

注：不同字母表示差异显著水平P<0.05。表2-9同。

Note: Different letters indicate that the significant differenceP<0.05. The same as Tab.2-9.

2.2 追施氮肥对沙地燕麦叶绿体色素含量的影响

2.2.1 对叶绿素a含量的影响 如表2所示，不同施氮水平下燕麦不同部位叶片中叶绿素a含量变化较大，总体趋势是旗叶中叶绿素a含量>倒二叶中叶绿素a含量>倒三叶中叶绿素a含量。随着施氮量的增加燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中叶绿素a含量呈先上升后下降的趋势，其中，N210处理水平燕麦旗叶中叶绿素a含量最高，达到2.20 mg/g，显著高于N0、N70、N140处理，与N280相比无显著差异；N140处理水平下燕麦倒二叶中叶绿素a含量最高，达到1.54 mg/g，显著高于N0、N70、N280处理，分别高1.11,0.62,0.55 mg/g；N140处理水平下燕麦倒三叶中叶绿素a含量亦是最高，为1.20 mg/g，但与N210、N280相比无显著差异，显著高于N0和N70。说明施用氮肥可有效增加燕麦叶片中叶绿素a含量。

表2 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦叶片叶绿素a含量Tab.2 Chlorophyll a content of oat leaves under different nitrogen fertilizer treatments at grain filling stage in sandy land mg/g

2.2.2 对叶绿素b含量的影响 由表3可知，不同施氮水平对燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中叶绿素b的含量影响不同，总体趋势与叶片中叶绿素a含量的变化一致，旗叶中叶绿素b含量>倒二叶中叶绿素b含量>倒三叶中叶绿素b含量。旗叶叶片中叶绿素b含量最高的是N210处理，含量为1.60 mg/g，显著高于N0、N70、N140，与N280相比无显著差异，N70、N140和N280处理亦显著高于N0；倒二叶和倒三叶中叶绿素b含量变化随施氮量的增加变化趋势相同，均是先增加，在N140处理下达到最大后下降，但N140、N210、N280处理下叶绿素b含量无显著差异，均显著高于N0和N70；N70处理下倒二叶、倒三叶叶片中叶绿素b含量显著高于N0，分别高0.31,0.47 mg/g。

表3 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦叶片叶绿素b含量 Tab.3 Chlorophyll b content of oat leaves under different nitrogen fertilizer treatments at grain filling stage in sandy land mg/g

2.2.3 对类胡萝卜素含量的影响 由表4可知，燕麦施入氮肥后显著增加旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中类胡萝卜素含量，但不同施氮水平燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中类胡萝卜素含量无显著差异。旗叶叶片中类胡萝卜素含量大于倒二叶和倒三叶中含量，倒二叶和倒三叶叶片中类胡萝卜素含量无明显差异。说明施氮可增加燕麦叶片中类胡萝卜素含量，但施氮量多少与叶片中类胡萝卜素含量无相关性。

表4 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦叶片类胡萝卜素含量 Tab.4 Carotenoid content of oat leaves under different nitrogen fertilizer treatments at grain filling stage in sandy land mg/g

2.3 追施氮肥对沙地燕麦抗氧化酶活性的影响

2.3.1 对过氧化物酶活性的影响 由表5可知，不同施氮水平下燕麦不同部位叶片中POD活性变化具有差异，表现为旗叶叶片中POD活性>倒三叶叶片中POD活性>倒二叶叶片中POD活性。随着施氮量的增加旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中POD活性呈先增加后降低的趋势，其中N210处理下，旗叶叶片中POD活性最高，为388.00 U/(g·min)，显著高于N0、N70、N140、N280；N140处理下，倒二叶和倒三叶叶片中POD活性均最强，分别为285.00,345.67 U/(g·min)，倒二叶和倒三叶N210处理下叶片中POD活性显著高于N0、N70、N280，但倒二叶N210处理下叶片中POD活性显著低于N140，倒三叶中N210处理下叶片中POD活性与N140相比无显著差异。说明施氮肥不同程度上增强燕麦叶片中POD活性，且受施氮量多少的影响，不同功能叶表现不同。

表5 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦叶片POD 活性Tab.5 POD activity of sandy oat with different nitrogen treatments in filling stage U/(g·min)

2.3.2 对超氧化物歧化酶活性的影响 如表6所示，氮肥处理对燕麦不同部位叶片中SOD活性影响不同，表现为倒三叶叶片中SOD活性>倒二叶叶片中SOD活性>旗叶叶片中SOD活性。旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中SOD活性最强的均是N0，分别为162.81,182.37,227.55 U/g，均显著高于N210处理下叶片中SOD活性；旗叶叶片中SOD活性N0与N280无显著差异；N70、N140处理下旗叶叶片中SOD活性显著低于N0、N280；倒二叶和倒三叶叶片中SOD活性N0、N70、N140及N280均无显著差异。施氮对燕麦旗叶叶片中SOD活性影响较大，说明燕麦衰老进程中叶片SOD活性降低。

表6 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦SOD 活性Tab.6 SOD activity of sandy oat with different nitrogen treatments in filling stage U/g

2.3.3 对过氧化氢酶活性的影响 由表7所示，不同施氮水平下燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中CAT活性有明显变化。旗叶叶片N210处理下CAT活性最强，为35.13 U/(g·min)，显著高于N0、N70、N280，但与N140处理相比无显著差异；倒二叶叶片N140处理下CAT活性最强，为33.00 U/(g·min)，显著高于N0、N70、N280；倒三叶叶片中CAT活性最强的是N210处理，显著高于N0及N70，N0燕麦叶片中CAT活性最弱，为18.93 U/(g·min)。

表7 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦CAT 活性Tab.7 CAT activity of sandy oat with different nitrogen treatments in filling stage U/(g·min)

2.4 追施氮肥对沙地燕麦可溶性蛋白含量的影响

由表8可知，氮肥处理下燕麦旗叶叶片中可溶性蛋白含量>倒二叶叶片中可溶性蛋白含量>倒三叶叶片中可溶性蛋白含量。不同水平氮肥处理对燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶片中可溶性蛋白含量影响不同，其中N210处理下旗叶叶片中可溶性蛋白含量最高，达到64.54mg/g，显著高于N0、N70，分别高32.16，18.24 mg/g,与N140、N280相比无显著差异；倒二叶叶片中可溶性蛋白含量最高的亦是N210处理，显著高于N0，但与N70、N140、N280相比无显著差异；倒三叶叶片中可溶性蛋白含量最高的是N280处理，显著高于N0，与N70、N140、N210处理相比无显著差异，但N70、N140、N210处理下叶片中可溶性蛋白含量与N0相比无显著差异。

表8 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦叶片可溶蛋白含量Tab.8 Soluble protein content of sandy oat leaf with different nitrogen treatments in filling stage mg/g

2.5 追施氮肥对沙地饲用燕麦丙二醛含量的影响

根据表9可知，施氮处理后燕麦不同部位叶片中丙二醛含量有所差异，旗叶叶片中丙二醛含量大于倒二叶和倒三叶，而倒二叶和倒三叶叶片中丙二醛含量变化无明显规律。旗叶叶片中丙二醛含量最低的是N210处理，为10.50 nmol/g，显著低于N0、N70；N0、N70、N140处理倒二叶叶片中丙二醛含量显著高于N210、N280处理，N0、N70、N140之间和N210、N280之间倒二叶叶片中丙二醛含量均无显著差异；倒三叶叶片中丙二醛含量最高的是N0，高达9.77 nmol/g，显著高于N140、N210处理，与N70、N280相比无显著差异。说明过多施氮或不施氮燕麦叶片中丙二醛含量均上升，亦可能会增加燕麦叶片的衰老进程。

表9 不同氮肥处理下灌浆期沙地燕麦丙二醛含量Tab.9 MDA content of sandy oat with different nitrogen treatments in filling stage nmol/g

3 结论与讨论

氮素是麦类植物生长发育最重要的影响因素之一。李淑文等[24]研究表明，小麦在缺氮条件下植株叶面积指数减小，路文静等[25]研究表明旱茬小麦在低氮条件下，氮低效小麦叶片中叶绿素含量减少。本研究结果表明，在一定施氮范围内，随着施氮量的增加燕麦旗叶、倒二叶、倒三叶叶面积逐渐增大，叶片中叶绿素含量逐渐增加，当施氮量为210 kg/hm2时，燕麦旗叶、倒三叶叶面积最大，旗叶中叶绿素含量最高，说明适宜的施氮条件下有利于燕麦叶片正常生长，这与李淑文等[24]的研究结果一致。氮素是同化作用器官的重要组成部分，植株中氮素积累与运转能力的强弱制约着叶片的光合性能，当植株缺氮时叶片中叶绿素、可溶性蛋白质等相关酶类[26]的合成受阻，从而导致叶部分功能降低。本试验亦表明,当施肥量过高亦会影响燕麦叶面积减小、叶片中叶绿素的合成降低，从而影响功能叶的光合作用，可能加速植株的衰老。

许多植物衰老叶片中丧失的蛋白质主要是可溶性蛋白。丧失的可溶性蛋白主要是RuBisCO，它位于叶绿体间质中，在叶片衰老前，作为光合作用的关键酶为植物固定CO2做出贡献[27]，因此,叶片自然衰老过程中可溶性蛋白含量的变化可以作为叶片衰老程度的指标。本试验中，随着施氮量的增加燕麦叶片中可溶性蛋白含量随之增加，当施氮量为280 kg/hm2时，燕麦叶片中可溶性蛋白含量明显降低，这与路文静[25]、张承烈[28]等研究结果相似，说明210 kg/hm2施氮量水平下燕麦叶片中可溶性蛋白合成条件最佳，有利于燕麦植株生长。

研究表明，逆境胁迫因素可诱发植物组织细胞内产生过量的H2O2等活性氧(ROS)，ROS 过剩积累会造成膜系统、蛋白质和 DNA 分子结构等的损伤。为抵御 ROS 对细胞的毒害，植物细胞便启动一些活性氧清除机制，SOD、POD、CAT 是植物体内清除过量活性氧的重要酶促防御系统，可减轻或避免植物体的氧化损伤，SOD、POD、CAT活性强弱对植物正常生长至关重要[29]。袁昌洪等[26]研究表明，随着施氮量的增加，茶树叶片中SOD活性呈先升高后降低的趋势，这与本试验结果不同，本研究表明，随着施氮量的增加燕麦叶片中SOD活性呈先降低后升高的趋势，这可能是由于研究植物不同而出现相反结论。施大伟等[30]研究表明，抗氧化酶系统中，POD比SOD对旗叶的衰老影响较大，本研究亦证明此观点，本研究燕麦叶片中POD和CAT活性随着施氮量的增加而均显著增加，当施氮量达到280 kg/hm2时叶片中POD和CAT活性明显下降，说明POD和CAT对于清除叶片内活性氧起重要作用。丙二醛能抑制细胞保护酶的活性和降低抗氧化物的含量，是膜质过氧化的最终分解产物[31]。袁昌洪等[26]研究表明，随着施氮量的增加，茶树叶片中MDA含量先增加后降低，李京涛等[32]研究表明，有机肥和一定量的氮肥配合施用能显著抑制植株细胞膜脂过氧化过程，从而延缓植株衰老进程。本研究结果与此相同，随着施氮量的增加，燕麦叶片中MDA含量呈先降低后升高的趋势，旗叶、倒二叶、倒三叶均是210 kg/hm2施氮处理下MDA含量最低，这与N210处理下POD和CAT活性最强有关。

追施氮肥通过提高燕麦叶面积、叶片中叶绿素含量、可溶性蛋白含量，提高燕麦的光合效率，同时通过增强叶片中POD和CAT活性清除叶片中的活性氧，从而降低叶片中的MDA含量，达到推迟燕麦衰老的目的，且科尔沁沙地维持燕麦植株抗衰老能力的最佳氮肥施用量为210 kg/hm2。