基于线粒体D-loop序列的长江口中华鲟幼鱼遗传多样性分析

孙丽婷,赵 峰,张 涛,纪 严,庄 平

(1中国水产科学研究院东海水产研究所，中国水产科学研究院长江口渔业生态重点实验室，上海 200090；2上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

中华鲟(Acipensersinensis)属鲟形目(Acipenseriformes)，鲟科(Acipenseridae)，鲟属，为我国一级水生野生保护动物，是一种典型的江海洄游型鱼类，生活史极其复杂。每年6—8月，性腺发育至Ⅲ期的成体由东海经长江口，洄游进入长江，于翌年的10—11月在上游产卵场进行繁殖，产后亲鱼即返回海洋[1]。仔鱼孵化后顺流而下，在翌年4月末至5月初时到达长江口，经过4～5个月的索饵肥育于8月末至9月初洄游进入海洋生活[2]。20世纪中后期以来，由于大型水利工程修建、水体污染和过度捕捞等因素的影响，中华鲟野生种群呈衰退趋势，洄游至葛洲坝下产卵场的繁殖群体呈现出数量下降、雌雄性比失衡、繁殖频次下降、繁殖规模减小和产卵活动延迟等现象[3-7]。近年来，中华鲟野生种群衰退的趋势进一步加剧。2010年，世界自然保护联盟(IUCN)将中华鲟列入濒危物种红色名录极危(CR)物种行列。2013年以来，每年到达葛洲坝下产卵场的繁殖群体已不足50尾[8]。更为严重的是，2013年、2015年和2017年的繁殖季节，均未监测到自然繁殖活动，仅2014年和2016年发生自然繁殖，野生种群出现了偶发产卵现象[7]。

遗传多样性是保护生物学研究的核心之一，及时了解和掌握物种种内遗传变异的大小、时空分布及其与环境的关系，有助于采取科学有效的措施对濒临灭绝的物种加以保护和拯救。已有研究表明，无论是在蛋白质水平还是核DNA水平，中华鲟野生群体的遗传多样性比洄游鱼类的平均水平偏低[9-11]；葛洲坝截流以后，中华鲟野生幼鱼群体的遗传多样性又进一步降低[12]。近几年微卫星标记数据显示，中华鲟野生幼鱼群体的遗传结构趋于稳定[13]。本研究利用线粒体控制区(mitochondrial control region, D-loop)序列分析技术，研究了2015年和2017年长江口野生中华鲟幼鱼的遗传多样性，旨在及时了解和掌握长江口中华鲟野生幼鱼的遗传多样性状况并推算参与自然繁殖的雌性亲本数量，为相关物种保护和管理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

利用2015年和2017年春夏季在上海崇明长江口东滩及其临近水域监测及渔民误捕的野生中华鲟幼鱼为实验样本(表1)。误捕死亡的个体取背部肌肉，存活的个体取鳍条，分别保存于无水乙醇备用。

表1 野生中华鲟幼鱼样本Tab.1 Samples of wild juvenile Acipenser sinensis

1.2 基因组DNA的提取

取肌肉(鳍条)约100 mg，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京，天根生化科技有限公司)提取总DNA，-20 ℃保存。

1.3 线粒体D-loop序列的PCR扩增、纯化与测序

使用引物DL: 5′CAAGAACACAAGATTAAT GAG3′ ; H740: 5′ GATCAAGGTATGTCGATGACA 3′[14]，扩增中华鲟的mtDNA 的D-loop部分序列。PCR 总反应体系为25 μL，其中包括：10×PCR buffer 5 μL, dNTP 4 μL (2.5 mmol·L-1)，上下游引物各1 μL (10 mmol·L-1),TaqDNA 聚合酶0.8 μL (5 U·μL-1)，模板DNA 1μL, 加双蒸水至总体积 25 μL。样品在AG-22331 型PCR 仪(Eppendorf) 上进行扩增, 94 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃ 30s, 51 ℃ 45s, 72℃ 1min, 35个循环; 72 ℃ 延伸10 min; 4 ℃ 保存。扩增产物使用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海杰李生物技术有限公司进行胶回收双向测序。测序结果采用BLAST在NCBI数据库中进行比对分析。

1.4 数据分析

利用Clustal X[15]对序列进行对位排列并结合人工核查与校正。利用DnaSP5.0软件[16]确定单倍型数目及分布、核苷酸多样性等。MEGA5.1[17]计算其碱基含量、变异位点数、简约信息位点数、群体内及群体间的遗传距离。使用MEGA5.1软件[17]中的邻接法(neighbor-joining，NJ)构建单倍型之间的系统发生聚类树，单倍型聚类树中节点处的置信度用Bootstrap 1000次重复检验。利用Arlequin3.1[18]进行分子变异方差分析(AMOVA)评估群体间的遗传变异。使用分化指数(Fst)[19]评价群体间的遗传差异，使用1000次重复抽样检验群体间Fst的显著性。群体间的基因流通过公式Nm= (1-Fst)/(4Fst)计算。

2 结果与分析

2.1 序列变异特征

2个年度830个野生中华鲟幼鱼的线粒体D-loop区可比序列长度为462 bp，变异位点26个(包括插入和缺失位点)，变异比率5.63%，其中简约信息位点8个，单变异位点18个，变异多为转换和颠换，有1个插入缺失位点(图1)。4种碱基C、T、A和G的平均含量分别为17.54%、32.22%、26.83%和23.41%。中华鲟幼鱼线粒体D-loop的碱基组成具有较大的偏向性，C的含量显著低于其它3种碱基的含量，A + T(59.05%)含量显著高于G + C(40.95%)。

图1 中华鲟线粒体控制区序列的变异位点Fig.1 Variable nucleotide sites of mtDNA D-loop of Acipenser sinensis

2.2 单倍型分布及遗传关系

在2015年的672个样本中检测到11个单倍型，2017年158个样本中检测到8个单倍型，2个年度个体的单倍型分布如图2所示。2个年度间共享单倍型有3个，占单倍型总数的18.75%； 2015年个体拥有8个特有单倍型，其中Hap5的出现频次最高，共221个，占32.89%，Hap8和Hap11均只有1个个体。2017年个体拥有5个特有单倍型，其中Hap12出现的频次最高，共31个，占19.62%。

2.3 中华鲟的遗传多样性和遗传结构

中华鲟2个年份样本间的遗传多样性参数见表2。2015年样本共11个单倍型，单倍型多样性(h)0.799±0.008，核苷酸多样性(π)0.009 3±0.005 1，平均核苷酸差异数4.005；2017年样本共8个单倍型，单倍型多样性(h)0.848±0.008，核苷酸多样性(π)0.012 3±0.006 6，平均核苷酸差异数5.081，2017年幼鱼的遗传多样性略高于2015年。

从遗传距离来看，2015年与2017年幼鱼样本间的遗传距离为0.0102，没有明显的分化现象；各单倍型之间的平均遗传距离为0.0124。两个年度样本间的Fst值为0.0830 4(表3)，基于Fst计算年度样本间的基因流Nm为2.76。AMOVA分子变异方差分析表明，长江口野生中华鲟幼鱼两个年度群体间的变异为8.30%，群体内变异为91.70%，群体内变异大于群体间变异。

图2 中华鲟16个单倍型的分子系统树及其分布Fig.2 Distribution of 16 haplotypes between 2 populations of Acipenser sinensisand its NJ molecular phylogenetic tree注：节点数字表示>50%的Bootstrap 支持率；括号内为样本数(2015/2017)Note: Numbers at nodes indicate bootstrap values greater than 50% with 1000 replicates， and the sample sizes are given in parentheses (2015/2017)

表2 野生中华鲟幼鱼的遗传多样性参数Tab.2 Parameters of genetic diversity of wild juvenile Acipenser sinensis

表3 中华鲟群体的AMOVA分析结果Tab.3 Results of AMOVA for Acipenser sinensis populations

注：Va、Vb分别表示群体间变异和群体内变异

Note:Va,Vbmean variations among populations and within populations

3 讨论

3.1 中华鲟的繁殖群体规模

mtDNA遵循严格的母系遗传，一般不发生重组，后代能够完整的保存母本遗传信息，mtDNA一个单倍型即可代表一个母系集团，较少的样本就能反应群体的遗传结构[20]。根据2015年和2017年长江口中华鲟幼鱼线粒体DNA的D-loop区序列单倍型数量，我们推测2014年参与自然繁殖的雌性亲鱼数量至少有11尾，2016年至少有8尾。廖小林等[21]对2016年采集的95颗中华鲟受精卵测序分析显示，坝下产卵场至少有10尾雌鱼参与了自然繁殖，本研究结果与之相差不大。

调查显示，2014年长江葛洲坝下游宜昌江段的中华鲟繁殖群体数量为57尾，2016年繁殖季节产卵场水声学探测数量为48尾[8]。根据历史数据葛洲坝下中华鲟繁殖群体的雌雄性比为5.86∶1[3]，推算出2014年的57尾亲鱼中约有49尾雌鱼，8尾雄鱼；2016年的48尾亲鱼中约有41尾雌鱼，7尾雄鱼。葛洲坝截流后，到达坝下产卵场的亲鱼出现了不同程度的性腺退化现象[22-23]，繁殖群体的性腺成熟比例从截流前的35%～50%[24]下降到10%～30%[25]，据此计算得到2014年参与自然繁殖的雌性亲鲟在5～15尾，2016年4～12尾，本研究与计算结果较为吻合。

根据长江口幼鱼监测数据，2015年幼鱼到达长江口的规模大，数量多达上千尾[8]，而2017年春夏到达长江口的中华鲟幼鱼规模较小。根据本研究的结果，2017年参与自然繁殖的雌性亲本数量略小于2015年，与监测数据相符。葛洲坝截流初期坝下产卵场调查显示，在1983—1985年，年均有26尾亲鲟参加产卵，性比稳定在1∶1左右，1986年后每年有30～40尾亲鱼在坝下产卵[26]。当前坝下产卵场参与产卵的雌性亲鱼在10尾左右，性比失衡，中华鲟自然繁殖群体规模下降趋势明显；2005—2013年间，长江口中华鲟幼鱼的补充量波动剧烈，总体呈下降趋势[27]；近两年发生偶发产卵现象后，长江口中华鲟幼鱼资源丰欠差异明显，中华鲟的群体补充岌岌可危。

3.2 中华鲟群体的遗传多样性

从线粒体D-loop区序列分析来看，2015年和2017年长江口中华鲟幼鱼的平均单倍型多样性为0.857 ± 0.006，平均核苷酸多样性为0.010 2± 0.005 5。其中，2017年野生幼鱼的遗传多样性略高于2015年的野生幼鱼群体。已有研究表明，1995—2000年间长江中野生中华鲟繁殖群体(该样本能代表葛洲坝截流前的中华鲟野生群体)的线粒体D-loop区平均单倍型多样性为0.949±0.010，平均核苷酸多样性为0.011±0.006[28]。与之相比，当前野生中华鲟群体的遗传多样性低于截流前，但仍然具有较高的遗传多样性水平。中华鲟个体生活周期长达十几年，甚至几十年，生活史极其复杂。在其生活史中，个体初次性成熟的时间不同，同一世代的不同个体进行生殖洄游的时间不一致，同年到达产卵场的繁殖群体的年龄和世代结构比较复杂[3]；在进行首次繁殖后有数年的繁殖间期[29]，相邻2～3年间群体的相似性很小，这样会极大地降低近交衰退的几率，这对中华鲟有效维持种群遗传多样性起到重要作用。由于亲本数量极少，不同年度间繁殖群体的差异，可能也是造成2015年与2017年幼鱼样本遗传多样性差异的原因。

从单倍型分析来看，2个年份的中华鲟幼鱼群体具有共享单倍型，说明其可能在历史上具有共同的母本。AMOVA分析显示，年度样本间的变异为8.30%，群体内的变异为91.70%，群体内变异大于群体间的变异，单倍型之间的平均遗传距离(0.012 4)略高于年度样本之间的遗传距离(0.010 2)。以上结果均表明，中华鲟作为一个单一种群，其遗传变异主要来源于群体内。在张四明等[29]的研究中，截流前的野生中华鲟群体年度样本之间没有明显的分化现象；赵娜等[11]通过对等位基因的分布进行聚类运算也得到，中华鲟群体的年度样本之间差异小，遗传差异主要存在群体内。这种遗传结构能够使中华鲟种群的遗传多样性水平得以维持，不致因某一世代繁殖受阻或数量减少而骤降，有助于维持种群的遗传多样性。本研究中，2015年与2017年群体之间Fst为0.083 04 (0.05

尽管目前野生中华鲟种群仍然维持着相对较高的遗传多样性，但从已有研究可以看出，相比长江葛洲坝截流前，2000年时长江口中华鲟幼鱼遗传多样性水平已然在下降[12]，2015年的微卫星标记研究结果也证实了野生中华鲟幼鱼的遗传多样性水平逐渐降低的趋势[31]。当前日渐衰竭的种群资源量，势必会导致群体中发生遗传漂变和遗传多样性的逐渐丧失，中华鲟面临灭绝的危险，恢复野生中华鲟种群资源迫在眉睫。通过分子生物学手段了解中华鲟现有种群遗传结构，以确定保护单元，建立人工种群并对其进行迁地保护。在当前的全人工繁殖技术和保护遗传学的基础上，可在不同的养殖环境中建立不同的人工种群，互相补充，保证人工种群的遗传多样性，以保存中华鲟的种质资源。

致谢：中国水产科学研究院东海水产研究所马春艳副研究员、汕头大学马洪雨教授在实验过程中给予很大的帮助，一并表示感谢!