运用信息熵理论优化真方白丸胶囊提取工艺△

皮凤娟，张庆莲，黄娟*，邵单炫，廖光辉

1.泸州市中医医院，四川 泸州 646000；2.内江良辉药业有限公司，四川 内江 641000

熵[1]是物理学中的一个重要概念，表示了任何一种能(能量)在空间分布的均匀程度。1865年，克劳修斯在研究如何提高蒸汽机效率的基础上，提出了熵问题。一般而言，当一种信息出现概率更高的时候，表明它被传播得更广泛，或者说，被引用的程度更高。我们可以认为，从信息传播的角度来看，信息熵可以表示信息的价值。本实验将信息熵理论运用于多指标评价的权重系数确定，用于客观评价正交试验所优选的工艺。

“脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”“脑血管意外”(cerebralvascular accident，CVA)，是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60%～70%[2]。真方白丸子为元代《瑞竹堂方》所载，主要药物有川乌头、白附子、半夏、天南星、天麻、全蝎等。方中半夏、天南星、白附子祛风化痰；天麻、全蝎息风通络；川乌以其大辛大热助其温通经络，而枳壳、木香则是以其行气之力助其疏通经络，主治中风病之半身不遂，于明代中叶失传[3]。目前，该方被发掘出来后即受到学术界的普遍重视，已成为治疗中风急性期中经络的一个主要方剂。但因其剂型为传统的丸剂，服用不便，且处方中含有虫类药材，具有不良气味。现根据处方中药物的特点，考虑将其改进成胶囊剂，掩盖药物不良嗅味，提高生物利用度。笔者根据方中药味主要成分的性质，确定对胆南星、枳壳、制川乌、制白附子等药材进行水提[4]。由于《中华人民共和国药典》2015年版一部未对制白附子、法半夏、胆南星含量测定进行相关规定，经查阅文献，胆南星中总胆酸具有抗炎、镇咳作用[5]，枳壳水提液中3种含量最高的成分从高到低依为柚皮苷、新橙皮苷及异柚皮苷[6]，故以总胆酸、柚皮苷、新橙皮苷及干膏得率为指标，运用信息熵确定各指标权重系数。

1 仪器与材料

FA2004型电子天平(上海安亭电子仪器厂)；ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；紫外分光光度计；恒温水浴锅。

鹅去氧胆酸对照品(批号110806-201507)、柚皮苷对照品(批号110722-201312)、新橙皮苷对照品(批号111857-201703)(中国食品药品检定研究院)；所用试剂均为分析纯；水为纯化水。

胆南星(批号：170401)由内江良辉药业有限公司提供，经泸州市中医医院副主任中药师张世波鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 柚皮苷与新橙皮苷含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 安捷伦色谱柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸(20∶80)为流动相；流速为1 mL·min-1；检测波长为283 nm；进样量为10 μL；柱温30 ℃[7-8]。

2.1.2 溶液的制备 供试品溶液制备：按处方量比例称取制川乌9 g，制白附子9 g，法半夏9 g，枳壳9 g，胆南星9 g，木香9 g，共计54 g药材，加10倍量的水，浸泡半小时，煎煮3次，每次1 h，过滤，取滤液5 mL，精密加入25 mL甲醇，称定，超声处理30 min后再次称定，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得。

对照品溶液制备：精密称取柚皮苷、新橙皮苷对照品各5 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别吸取上述对照品溶液各2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成混合对照品溶液。

阴性对照品溶液：按处方量比例称取除枳壳外的水提药材，按照供试品溶液制备的方法，制备缺枳壳的阴性对照溶液。

2.1.3 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺枳壳阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件检测。结果对照品溶液和供试品溶液在相同的保留时间均有出峰，阴性对照无干扰，见图1。

注：A.缺枳壳阴性液；B.柚皮苷和新橙皮苷对照品液；C.供试品溶液；1.柚皮苷；2.新橙皮苷。图1 真方白丸胶囊水提液HPLC图

2.1.4 线性范围考察 精密称取柚皮苷对照品和新橙皮甘对照品适量，用甲醇稀释制成柚皮苷对照品质量浓度为0.020 16 ～0.205 8 mg·mL-1，新橙皮苷对照品质量浓度为0.020 52 ～0.171 0 mg·mL-1的混合对照品溶液，在上述色谱条件下，分别取混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=1582.1X+35.083(r=0.999 9)和Y=1 834.3X-17.546(r=0.999 9)。结果表明：柚皮苷在0.2～2 μg，新橙皮苷在0.2～1.7 μg进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 吸取2.1.2项下样品溶液适量，重复测定6次，结果柚皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD值分别为0.75%、0.79%，表明该方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密量取2.1.2项下混合对照品溶液，在0、2、4、6、8 h分别进样10 μL，记录2个成分的峰面积，计算RSD分别为0.41%、0.51%，结果表明柚皮苷和新橙皮苷均在8 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批样品6份，照2.1.2项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件平行操作测定，记录峰面积，计算含量。结果2个成分的RSD值均小于3.0%，表明本方法的重复性良好。

2.1.8 耐用性试验 取同一批样品，照2.1.2项下方法制备供试品溶液，改变色谱柱温度±5 ℃、流动相比例±5%，流速±2%，进行耐用性试验。结果RSD<3.0%，说明本方法稳定。

2.1.9 加样回收率试验 精密量取已知柚皮苷和新橙皮苷含量的样品2.5 mL，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，每份均精密加入质量浓度为0.170 6 mg·mL-1的柚皮苷对照品储备液5 mL，质量浓度为0.172 0 mg·mL-1新橙皮苷对照品储备液5 mL。照2.1.2项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件平行操作测定，记录峰面积，计算回收率，结果RSD<3.0%，说明加样回收率好。结果见表1～2。

2.1.10 含量测定 取3批真方白丸胶囊提取液，依法制备供试品液并测定柚皮苷和新橙皮苷的含量。3批真方白丸胶囊提取液柚皮苷平均质量浓度为0.264 mg·mL-1，新橙皮苷平均含量为0.249 mg·mL-1。

2.2 UV法测定总胆酸含量

2.2.1 溶液的制备 对照品溶液：取鹅去氧胆酸对照品5.02 mg，置10 mL量瓶中，用冰乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。分别精密移取对照品储备液适量至10 mL量瓶中，加冰乙酸稀释至刻度，制成质量浓度分别为50.2、2.51 μg·mL-1的对照品溶液[9-10]。

供试品溶液：取提取液2 mL，置锥形瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，水浴加热回流2.5 h，加入0.6 g活性炭，再加热回流0.5 h，过滤，蒸干，残渣加60%冰乙酸溶液溶解并稀释至10 mL，取1 mL稀释液加入14 mL 50%硫酸溶液，摇匀后于75 ℃水浴10 min，立即冰浴2 min，即得。

2.2.2 标准曲线的制备 分别精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0 mL的鹅去氧胆酸对照品溶液(质量浓度为0.050 2 mg·mL-1)置试管中，以60%冰乙酸溶液作为空白，于377 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，制作标准曲线，得回归方程Y=0.022 3X-7×10-6，r=0.999 9。结果表明，鹅去氧胆酸在0～0.016 73 mg·mL-1线性关系良好。

2.2.3 精密度试验 精密移取提取液2 mL，照供试品溶液项下方法制备，以60%冰乙酸为空白对照溶液，于377 nm处测定，重复操作6次，RSD为0.45%，表明仪器精密度好。

表1 柚皮苷加样回收率试验

表2 新橙皮苷加样回收率试验

2.2.4 重复性试验 精密移取提取液2 mL，共6份，照供试品溶液项下方法处理并测定吸光度。计算得到总胆酸平均质量浓度为28.509 mg·mL-1，RSD为2.59%，表明该方法的重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取2.2.3项下其中一份样品，分别于0、0.5、1、1.5、3、6 h测定其吸光度，RSD为2.35%，表明样品溶液在6 h内测定基本稳定。

2.2.6 准确度试验 精密移取提取液1 mL，6份，分别加入鹅去氧胆酸对照品溶液(质量浓度为2.51 μg·mL-1)1 mL，照供试品溶液制备方法操作，于377 nm处测定其吸收度，结果平均值为99.57%，RSD为2.89%。

2.2.7 样品含量测定 取3批真方白丸胶囊提取液，照2.2.1项下供试品制备方法制备并测定总胆酸含量。3批真方白丸胶囊提取液总胆酸平均质量浓度为0.174 mg·mL-1。

2.3 水提工艺的考察

2.3.1 因素与水平 以加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，每种因素取3个水平，以柚皮苷、新橙皮苷、总胆酸含量和干浸膏得率为考察指标，选用正交设计表L9(34)进行试验，因素水平见表3[11-13]。

2.3.2 数据处理 建立原始评价指标矩阵(X)，再将其转换成“概率”矩阵(P)。具体如下[14]。

计算各项指标的信息熵(Hi)，得到评价指标[0.991 29 0.991 32 0.957 41 0.984 59]，再计算第i项指标的系数Wi[0.115 53 0.115 07 0.564 95 0.204 45]。综合评分Mm=P1 m×W1+P2 m×W2+P3 m×W3+P4 m×W4，即柚皮苷提取率、新橙皮苷提取率、总胆酸含量、干浸膏收率的权重系数分别为0.115 53、0.115 07、0.564 95、0.204 45。

将概率矩阵的所有数据进行加权处理后，得到

综合评价指标M，再进行方差分析，结果见表4～5。

表3 正交试验因素水平表

表5 方差分析结果

注：F0.01(2，2)=99，F0.05(2，2)=19，*表示P<0.05，差异有统计学意义。

从表2可知，各因素对有效成分得率的影响程度依次为B>C>A，即煎煮次数>煎煮时间>加水量，故正交所得最佳提取工艺为A1B3C2。经研究发现，当加水量为6倍，提取3次时每次煎煮0.5 h所得结果与煎煮1 h和1.5 h接近；当提取次数为3次，每次煎煮30 min时加水量为10倍所得结果明显高于6倍和8倍。根据方差分析结果显示，A、C因素影响差异无统计学意义，B因素影响差异有统计学意义。综合直观分析和方差分析，同时考虑节约能源，确定最佳提取工艺为A3B3C1，即加10倍量水，煎煮3次，每次0.5 h。

2.3.3 验证试验 按上述优化条件进行验证试验，平行进行3次。柚皮苷平均提取率为88.74%，RSD为0.40%。新橙皮苷平均提取率为87.97%，RSD为0.81%。鹅去氧胆酸率平均含量为7.55 mg·g-1，RSD为1.50%。干浸膏平均得率为32.73%，RSD为0.41%。表明工艺稳定可行。

3 讨论

水提工艺中，笔者首先考察了药材的吸水率，结果发现，药材在前30 min内吸水最快，达40 mL，30 min以后吸水速度开始下降，浸泡6 h后不再吸水，故将浸泡时间确定为0.5 h[15]。

在UV法测定提取液总胆酸含量时，笔者考察了乙酸乙酯的加入体积对总胆酸含量测定的影响，结果发现，测定结果与乙酸乙酯加入体积无关，但与提取时所采用的冷凝管有关。提取时采用蛇形冷凝管比球形冷凝管的总胆酸含量高，可能是因为乙酸乙酯易挥发，蛇形冷凝管接触面大，更易于溶液的冷凝回流。

选用正交试验优化水提工艺参数过程中[16-17]，采用多指标综合评分法，以柚皮苷、新橙皮苷转移率、总胆酸含量和干浸膏为考察指标，根据信息熵理论[18-19]对其赋予不同的权重，并以此为基础进行综合评价。这种方法既在客观上保留了考察指标的完整性，又在理论上对各个指标进行客观的权重分配，使分析结果更加客观和科学，由此优选的工艺参数更合理，可为真方白丸胶囊的大生产提供参考。