内异方对EMs大鼠异位内膜中细胞增殖与凋亡影响的研究＊

周艳艳，付佳琳，雷 震

（1.河南省中医院 郑州 450002；2.河南中医药大学 郑州 450046；3.河南中医药大学第二临床医学院 郑州 450046）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是育龄妇女的常见病，其发病机制仍未完全明确[1-3]。近年来众多研究发现[4-6]，由于各种因素导致的子宫内膜相关凋亡基因表达异常，使内膜细胞在异位部位的生长能力增强，最终导致异位的内膜发展为EMs。细胞凋亡与EMs 发病密切相关，研究细胞凋亡在EMs 中的作用机制有着重要的意义。内异方由笔者根据尤昭玲教授经验方内异方[7]结合临床经验化裁而来，在临床治疗EMs 取得了较好的临床疗效，但作用机制尚不明确。本研究旨在通过实验，观察内异方对EMs 大鼠细胞增殖与凋亡的影响，基于化瘀解毒理论，探讨内异方对子宫内膜异位症的作用机制，为临床对本病的治疗提供思路与方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

兔抗大鼠NF-kB（B1101）、HIF-1α（B3301）抗体：武汉博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠Caspase-3（197677-1-AP）、Bax（50599-2-1g）、Bcl-2（196841）抗体、小鼠抗大鼠B-actin（60008-1-1g）抗体、羊抗小鼠IgG 抗体（SA00001-2）、羊抗兔IgG 抗体（SA00001-1）：武汉三鹰生物技术有限公司。

其他：微量BCA 蛋白检测试剂盒（23235），上海恒斐生物科技有限公司；MaxiLumin-WB 飞克级化学发光底物（20170112），北京索莱宝科技有限公司；蛋白电泳凝胶制备试剂盒（JC-PE022）、RIPA 裂解液（20170407），北京百智生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器

凝胶成像仪（Chemi Doc XRS+System，美国Bio-RAD 公司），电动玻璃匀浆机（DY89-Ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司），酶标仪（Spectra Max M2，美国Molecular Devices 公司）,赛多利斯电子精密天平（BT25S，德国赛多利斯公司），高速冷冻离心机（JW-3022HR，安徽嘉文仪器装备有限公司）。

1.2 药物

内异方的组成是土茯苓、土鳖虫、土贝母、鬼箭羽、大血藤、连翘、香附、黄芪、乌药（药物应用三九免煎中药颗粒，批号：1701001W）。

1.3 实验动物

选择同种未孕成年雌性8-10 周龄SD 大鼠120只，SPF 级，体重200-250 g。购自河南省实验动物中心，合格证号：No.41003100004372。采用IVC 独立通风方式饲养观察。喂食SPF 饲料，由河南省动物实验中心提供，实验过程中常规饲养。

适应性喂养3 d 后连续2 周每日定时进行阴道细胞学涂片检查，选择动情周期4-5 d，并连续有2 个或以上正常动情周期的大鼠造模。

1.4 病症结合EMs动物模型的建立

采用手术复制[8]结合人工干预法[9]建立EMs 瘀毒证模型：术后1周，待大鼠腹部切口基本愈合后进行以下干预：①用贴有纱布的止血钳夹鼠尾，使之保持激怒争斗状态，2 min·次-1，每周1 次；②用绷带细条束缚大鼠后肢，使之行走困难，30 min·次-1，每周1 次；③食用油1 mL/100 g 灌胃，每周1 次；④1g/L 肾上腺素皮下注射，0.2 mL·只-1，每周1 次。以上方法在1 周内随机交替进行。连续3周后剖腹探查异位内膜生长情况。

1.5 分组及给药方法

将造模成功的108 只大鼠随机分为6 组：模型组、常氧内异方低剂量组（常中低组）、缺氧内异方低剂量组（缺中低组）、常氧内异方高剂量组（常中高组）、缺氧内异方高剂量组（缺中高组）、散结镇痛胶囊组，每组18只。

给药方法：模型组灌服0.9%生理盐水、常中低组与缺中低组每日灌服内异方（10 g·kg-1，灌胃量为成人临床剂量的6.3 倍）、常中高组与缺中高组每日灌服内异方（20 g·kg-1）、散结镇痛胶囊组（0.5 g·kg-1）。以上各组大鼠每日1次，每次灌胃给药容积10 mL·kg-1，共28 d。

缺氧状态制作：将缺中低组、缺中高组大鼠IVC笼中注入混合气体（95%N2加5%CO2混合气体），每天灌注30-60 min。治疗过程中缺中低组死亡2只，缺中高组死亡3只。

1.6 用药过程中各组大鼠行为学观察

观察大鼠体重、饮食及饮水情况，眼结膜血管充血、耳廓唇周、爪甲尾部及舌质颜色情况，并观察其精神体征、反应情况。

1.7 异位内膜组织形态及病理学观察

在末次给药后第1 d 剖腹手术，取出异位内膜，剥离周围的脂肪肌肉组织，按照各组组别摆放。观察异位病灶大小、沿腹壁生长、与周围组织粘连情况、积液形态、病灶内血管情况等，并用游标卡尺测量异位内膜的大小，记录各组间的差异。HE 染色进行病理学观察。

1.8 蛋白印迹法检测NF-kB、HIF-1α、Caspase-3、Bax、Bcl-2

在末次给药第1 d 剖腹手术，冰上取各组异位内膜，称重后-80℃保存备用。蛋白样片严格按照蛋白印迹检测法步骤操作。

1.9 统计学处理

应用SPSS17.0 统计分析软件分析实验数据，其中计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，采用Spearman等级相关分析检验。

2 实验结果

2.1 内异方对大鼠一般状态的影响

模型组、缺氧组大鼠易激惹、烦躁，不易抓取，同笼中大鼠互相撕咬、打斗，缺氧组表现更明显。模型组随天数增加，上述外在变化继续加剧，3周后大鼠消瘦、毛发稀疏；缺氧组大鼠随灌胃给药天数的增加，上述症状稍有缓解。给予内异方两组常氧组大鼠随着灌胃给药天数的增加，上述症状缓解。散结镇痛胶囊组大鼠易激惹、烦躁、口渴、表情痛苦等外在表现随着灌胃给药天数增加无明显变化，随着灌药天数增加，体重增加缓慢、毛发稀疏、无光泽。

图1 大鼠异位内膜体积变化比较

2.2 内异方对大鼠异位内膜组织形态学的影响

模型组大鼠异位病灶较前增大，沿腹壁蔓延生长，可见病灶局部及盆腔粘连带，积液光亮、形态饱满，呈圆形或椭圆形囊泡，内有透明或半透明囊液，部分为粘稠不透明液体，可见血管形成。常中高组及常中低组大鼠异位病灶较前明显缩小，形态欠饱满，血管减少，前者病灶局部及盆腔粘连较后者明显减轻。缺氧中药两组组大鼠异位病灶大小改善略差于常氧中药组，局部及盆腔仍粘连，但病灶形态欠饱满，未见沿腹壁蔓延生长。与模型组相比，常中高组异位内膜体积缩小最明显，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1）。

2.3 内异方对大鼠异位内膜病理结构的影响

模型组异位内膜结构完整，呈子宫腔状或环形封闭式结构，内有囊肿形成。上皮为立方状或柱状上皮，大部分上皮细胞有分泌现象，间质致密，血管增生密集，并可见到少量腺体及炎细胞浸润；常氧中药两组异位内膜上皮层明显变薄，细胞低平，呈扁平状，甚至萎缩呈线状排列，细胞排列疏松，内膜脱落，间质细胞减少、小而稀疏，血管明显减少，未见明显增生及假腺体改变，纵切面异位内膜呈缝隙状、腺体萎缩，有纤维化倾向，且常中高组较常中低组表现更明显；散结镇痛胶囊组内膜上皮层变薄，细胞低平，呈扁平状，细胞疏松，甚至萎缩呈线状排列，内膜脱落，间质细胞减少，血管减少（图2）。

2.4 内异方对HIF-1α、NF-kB、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白表达的影响

图2 组织切片HE染色（×200倍）

与模型组相比，常中高组大鼠异位内膜中Hif-1α降低，差别有统计学意义（P＜0.05）（图3-B）；与模型组相比，常中低组、散结镇痛胶囊组Ems 大鼠NF-kB降低，差别有统计学意义（P＜0.05），常中高组显著降低（P＜0.01）（图3-C）；与模型组相比，其他各组Ems大鼠异位内膜中Caspase-3 水平均升高，差别有统计学意义（P＜0.05）（图3-D）；与模型组相比，常氧内异方组、缺氧内异方组及散结镇痛胶囊组异位内膜中Bax/Bcl-2 水平均升高，差别有统计学意义（P＜0.05）（图3-E）。

3 讨论

图3 治疗后各组大鼠异位内膜的蛋白表达比较

子宫内膜异位症（EMs）临床表现多样，主要包括痛经、盆腔包块、不孕和性交痛等，严重影响妇女的身心健康和生活质量，成为妇科临床的现代病、多发病和疑难病。该病在中医学属“月经不调”、“癥瘕”、“痛经”等范畴[10-12]，历代医家对其病因病机进行了探索，认为其病机较为复杂,但多与血瘀相关[13-15]，临床治疗应辨证论治。现代医学对本病发病学说众多，如：经血逆流、体腔上皮化生学说及淋巴和静脉播散、在位内膜决定论、医源性散播、内分泌、遗传因素、免疫因素等[16-19]，但每种学说并不能完全解释该病在实验及临床中的相关表现。迄今为止，确切的发病机制尚不完全清楚，近年来细胞的增殖与凋亡失衡学说是人们研究的热点[20,21]。

核转录因子-kB（NF-kB）在炎症反应、免疫应答、应激反应、细胞凋亡及病毒复制的调节中起作用，是凋亡反应关键的调控因子，能上调多种基因和细胞因子的表达，促进细胞增殖,阻止细胞凋亡而诱发EMs。了解NF-kB 在子宫内膜异位症中的作用，有助于阐明子宫内膜异位症的发病机制，进一步为子宫内膜异位症的治疗提供新思路。本研究结果提示NF-kB 在模型组异位子宫内膜细胞中呈高表达提示EMs 发病可能与NF-kB 的过度激活有关；灌胃给予内异方的各组大鼠异位内膜中NF-kB 水平明显低于模型组，提示内异方能抑制其过度表达。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）被称为“死亡蛋白酸”,是哺乳动物细胞调亡的关键蛋白酶，它一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免[22]。Bax、Bcl-2 是目前发现在线粒体凋亡通路中起重要调节作用的基因之一[23]。研究表明[24]，Bcl-2 与Bax 之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，当Bcl-2 蛋白过多时抑制细胞凋亡，当Bax 蛋白过多时促进细胞凋亡。有关Caspase-3、Bax/Bcl-2在子宫内膜异位症的异常表达已多方证实。本课题研究结果提示中药各组大鼠异位内膜中Caspase-3、Bax/Bcl-2 水平明显高于模型组。提示内异方可能通过增强Caspase-3、Bax/Bcl-2 表达，促进异位细胞凋亡来阻断异位内膜的增殖。

子宫内膜异位症种植学说指出，经期子宫内膜的螺旋小动脉收缩，使内膜处于缺氧的状态[25]，内膜碎片进入腹腔后缺氧继续存在，而适度的缺氧可减少内膜细胞的凋亡，有利于细胞的异位种植[26]。细胞内缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的稳定表达有利于提高异位内膜的种植能力，促进新生血管的形成[27]。说明HIF-1α在EMs 的发生发展中起着重要作用。本课题结果显示，常氧中药两组HIF-1α水平明显低于缺氧组。提示缺氧为异位子宫内膜生长的重要条件，内异方通过下调HIF-1α水平改善子宫内膜异位症表现。

子宫内膜异位症病变广泛、形态多样，临床表现复杂，异位内膜周期性出血所形成的结节、包块等，祖国医学称之为“离经之血”，离经之血蓄积于下焦，血聚为瘀、瘀聚为癥瘕。近年来虽然各医家对该病的病因病机认识不尽相同，但大都是以血瘀立论。即“瘀血”是产生子宫内膜异位症的关键。《灵枢·五音五味篇》云：“妇人之生，有余于气，不足于血，以其数脱血也”，这种有余于气的状态易引起肝失疏泄，肝郁气滞，气滞则血瘀。《景岳全书·妇人规》云：“瘀血留滞作，唯妇人有之。其证则或由经期，或由产后，凡内伤生冷，或外受风寒，或恚怒伤肝，气逆而血留…或积劳积弱，气弱而不行，总由血动之时，余血未净而一有所逆，则留滞日积而渐成癥矣。”总之内因外邪皆可导致瘀血内阻，瘀血既成，阻于胞脉胞络，下焦气化不利，水液代谢失调，日久生湿化浊，聚而化热蕴毒，表现为“瘀毒互结”的基本病机；另一方面，毒热内蕴，进一步煎熬营血，血运迟缓，加重瘀血，毒瘀凝结，导致疾病缠绵难愈。故本病病机是瘀毒互结，病位在肝，病在血分。

内异方由土茯苓、土鳖虫、土贝母、鬼箭羽、大血藤、连翘、香附、黄芪、乌药组成。方中土茯苓：甘淡平，归肝胃经，有解毒清热，除湿通络之功效，《本草正义》言：“土茯苓，利湿去热，能入络，搜湿热之蕴毒。”；土鳖虫咸寒，归肝经，具有活血化瘀，通经止痛之功效，临床常用于瘀血经闭及癥瘕痛块；以上二味化瘀活血，解毒通络共为君药。土贝母性微寒味苦，归肺脾经，入肺则制约肝之妄动，入脾则减弱肝之克制，功在散结解毒；鬼箭羽又名见肿消，性辛味苦寒，归肝经，辛能行，苦寒解毒，有破血通络、解毒消肿之功效；大血藤微苦微寒，归肝胆肺经，能散瘀止痛，清热消肿；连翘性微寒味苦，入心、肝、胆经，有清热解毒，散结消肿作用。以上四者助君药加强化瘀散结、清热解毒之力共为臣药。香附辛微苦甘，平。入肝、三焦经。有理气解郁，止痛调经功效，辛能散，微苦能降，微甘能和，为血中气药，一则行气以助瘀化，二则用在味苦药中防其凝滞；炙黄芪甘，温。归肺、脾经。具有健脾益气功效，能提高减弱之免疫力，方中更加入辛温之乌药既防诸药苦寒凝滞气血，又能止痛减轻症状共为佐使之药。综观全方补泻兼施、寒热并用，标本兼治，诸药合用共奏“化瘀解毒，疏肝消痈”之效。

综上所述，内异方对子宫内膜异位症确有疗效，其作用机制初步表明内异方有抑制NF-kB 的过度激活，下调多种基因和细胞因子的表达，减缓细胞增殖，激活异位内膜细胞的凋亡途径的作用，通过促进细胞凋亡，降低其在宫腔外的存活及种植能力而抑制异位内膜病灶发展。且缺氧在内异症的治疗中有一定意义，提示缺氧微环境可能与内异症的发生发展有关系，为内异症的防治提供新思路。