基于超高效液相色谱指纹图谱和主成分分析法评价不同主产地半枝莲的质量＊

杨敏娟，罗宇琴，官永河，朱德全

（广东一方制药有限公司 佛山 528244）

半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbataD.Don的干燥全草。其性寒，味辛、苦，具有清热解毒，化瘀利尿的功能，临床主要用于疔疮肿毒，咽喉肿痛，跌扑伤痛，水肿，黄疸，蛇虫咬伤等[1]。现代药理研究表明，半枝莲具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、增强免疫等生物活性[2]。半枝莲含有多种化学成分，主要成分为黄酮类化合物（Flavonoids）和二萜类化合物（Diterpenoids），还有生物碱（Alkaloids）、甾体（Steroids）、多糖（Polysaccharids）等成分[3]。

文献检索发现，半枝莲指纹图谱研究不多，主要涉及HPLC 及GC 等方法。如张同波[4]建立了12 份不同产地的半枝莲药材的HPLC 指纹图谱，可能由于受产地、气候和生态环境等影响，不同产地的半枝莲药材所含成分产生较大的差异。林敬明等[5]建立半枝莲单味药材的HPLC 鉴定方法。对10 份不同批次的半枝莲药材指纹图谱进行解析，确定了16 个共有峰，对不同批次半枝莲样品HPLC 指纹图进行相似度分析，结果显示所有样品与对照指纹图谱相似度均在0.88以上。王慧彬等[6]采用Discovery-C18 柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以甲醇-0.05%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，建立半枝莲的HPLC 指纹图谱的方法。通过对10 批不同产地半枝莲药材的研究建立了半枝莲药材的指纹图谱，其中确定13 个色谱峰为共有峰。10 批药材的相似度在0.985-0.744 之间。该方法提取简单，具有很好的稳定性、重复性和可行性。赵伟伟等[7]采用Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6 mm ×250 mm,5 μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相，建立了不同产地半枝莲药材的指纹图谱。该方法精密度、重现性以及稳定性良好。以野黄芩苷作为对照峰，确定了13个特征峰为其共有峰。采用中药色谱指纹图谱相似度软件进行测评，8 份药材的相似度介于0.953～0.768。主成分分析获得2 个主要成分，累积贡献率可达80.347%。应用指纹图谱并结合主成分分析，能够准确的评价半枝莲药材的质量。陈香爱等[8]采用反相高效液相色谱法，以甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶液进行梯度洗脱，建立了30批不同来源半枝莲药材的HPLC-UV 指纹图谱，确定了14 个共有峰，并对30批半枝莲及其混淆品的进行了相似度分析。24 批半枝莲药材的相似度均在0.7 以上，6 批混淆品均在0.4以下。该HPLC 指纹图谱鉴别方法具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，可作为半枝莲及其混淆品药材的鉴别方法。潘瑞景等[9]采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，结合化学计量学直观推导式演进特征投影法（HELP）和相似度分析（SA），对不同产地半枝莲及其混淆品白花蛇舌草和半边莲挥发性成分的指纹图谱进行了研究。分别从半枝莲、白花蛇舌草以及半边莲中定性定量出52、38、38 种化合物。其中半枝莲和白花蛇舌草的共有峰48个，半枝莲与半边莲的共有峰52 个。保留时间和每组分峰面积的相对标准偏差分别小于0.2%和6.1%。相似度计算结果显示9 个不同产地的半枝莲的相关系数均在0.766 0 以上，而混淆品的相关系数分别为0.419 9和0.405 9，可以有效的判别半枝莲及其混淆品。

文献记载半枝莲主产河北，山东，陕西、河南，江苏，浙江，台湾，福建，江西，湖北，湖南，广东，广西，四川，贵州，云南等省区[10]。90 年代以前，半枝莲以野生为主，90年代初期，开始试种并栽培成功，逐步在各地发展种植。从“康美中药网”、“中药材天地网”、“药通网”可以查询到，截止2017 年12 月22 日，目前产量比较大的，供应全国的半枝莲主产地有8个，分别分布在河南省驻马店市、河南省信阳市、湖南省邵阳市、安徽省阜阳市、四川省成都市双流县以及山东省济宁市，以上产地总产量占全国总产量的80%以上。

中药指纹图谱在一定分析技术的基础上，获得可以标示中药材的共有峰的色谱图[11]，具有整体性、模糊性和量化性的特点，能够全面体现中药材质量，已成为鉴别真伪、控制质量的重要方法[12]。主成分分析法是一种降维的统计方法[13]，依据贡献率大小（≥85%）用具有代表性的因子代替多个原始变量。近年来已被广泛应用于中药，尤其是指纹图谱上[14-17]，是一种独具特色的多指标评价技术。本项目组深入产地，就地取材，收集了三大主产地的26 批半枝莲，系统地对其指纹图谱进行研究，并结合主成分分析法，综合评价不同产地的半枝莲药材。

1 仪器与试药

表1 26批半枝莲药材信息

1.1 仪器

Vanquish 超高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司），ACQUITY UPLC H-Class 型超高效液相色谱仪（沃特斯公司）；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相飞行时间高分辨质谱联用系统（Waters Corporation,Milford,MA,USA），数据处理系统为MarkerLynx 4.1 工作站（Waters,Manchester,U.K.），Acclaim C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，2.2 μm），万分之一天平（梅特勒-托利多公司），百万分之一天平（梅特勒-托利多公司），电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试剂与试药

芹菜素-7-O-葡萄糖苷（纯度大于98%，四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq17072708）；野黄芩素（纯度大于98%，四川省维克奇生物科技有限公司，wkq17072710）；芹菜素（纯度大于98%，四川省维克奇生物科技有限公司，wkq17032405）；野黄芩苷（纯度91.3%，中国食品药品检定研究院，批号：110842-201508）；半枝莲对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121293-201404）；石油醚、甲醇、乙醇（分析纯）；甲酸、磷酸、甲醇（色谱级）；水为超纯水（实验室自制）；26批半枝莲药材信息详见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Acclaim C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，2.2 μm）；进样量为1 μl；柱温为30℃；检测波长为335 nm；流速为0.4 mL·min-1；以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱，梯度为0-3 min，25%→29%A；3-10 min，29%→34%A；10-16 min，34%A；16-20 min，34%→42%A；20-28 min，42%A；28-35 min，42%→75%A。

2.2 质谱条件

氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：3.0 KV；锥孔电压：35 V；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：300℃；脱溶剂气流速：800 L·h-1；扫描时间：0.5 s；扫描时间间隔：0.02 s；质荷比范围：50-1 500；数据采集模式：centroid；以甲酸钠溶液校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽（Leucineenkephalin）为内标校正质量精度，LockSprayTM 流速5 μL·min-1。

2.3 溶液制备

2.3.1 参照物溶液的制备

精密称取野黄芩苷对照品、芹菜素-7-O-葡萄糖苷对照品、野黄芩素对照品和芹菜素对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别约为100 μg·mL-1的混合溶液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备

取半枝莲药材粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，回流30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

取S1 样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6 次，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3.0%，该仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取S1 样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别在0，2，4，8，12，16，20，24小时测定，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积的稳定性，显示，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，该供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验

取S1 样品，按“2.3.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分析，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%，该方法重复性良好。

2.5 色谱峰的指认

图1 半枝莲样品色谱峰的指认

取S1 样品约0.1 g，流动相为甲醇（A）-0.2%甲酸溶液（B），其他同“2.3”、“2.1”和“2.2”项下的条件。通过比对化合物的色谱峰保留行为、精确分子量以及对照品，半枝莲样品UPLC指纹图谱中4个色谱峰得到明确的指认，分别为野黄芩苷（峰3）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（峰5）、野黄芩素（峰9）和芹菜素（峰11），如图1所示；各色谱峰的峰号、保留时间、名称、CAS 号、分子式和结构式见表2。

2.6 指纹图谱的建立和相似度评价

按“2.3.2”项下方法制备26 批半枝莲药材供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，对所得到的指纹图谱数据进行分析，结果见表3；将结果导入国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）”，以S1 样品的图谱作为相似度计算校正的参照谱，时间窗宽度设为0.10 s，建立共有模式和指纹图谱叠加图，并计算各批次与对照指纹图谱的相似度，结果见图2、3 和表4。结果表明，确定26 批半枝莲样品中有11 个共有峰，所有指纹峰的相对保留时间RSD 均小于2.0%，相对峰面积RSD 范围为31.0%-118.5%，说明3 个产地半枝莲各成分含量存在一定差异；26 批半枝莲药材的相似度范围为0.871-0.999，不同产地半枝莲中的各成分和比例较有一定的差异。

2.7 主成分分析

采用SPSS 19.0 统计软件对26 批半枝莲药材共有峰的峰面积进行标准化处理，存为变量并作主成分分析，计算其主成分特征值累积贡献率、初始因子载荷矩阵及综合得分。

相关系数的特征值和方差贡献率见表5，初始因子载荷矩阵见表6。由表5、6 可知，第1 主成分的特征根为6.328，累计贡献率为57.528%，野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡糖糖苷、成分1、4、6、7、8 及10 在第1 主成分上有较高载荷，说明第1 主成分主要反映了以上8个成分的信息；第2 主成分特征根为1.833%，累计贡献率为16.662%，主要反映了野黄芩素和芹菜素的信息。以主成分为变量得到得分图4，由图可知，距离原点较远的几个点就是主成分1 和2 中权重值大的成分，其在决定产地差异上具重大作用。

图2 半枝莲药材的UPLC共有模式图

表2 指认峰的相关信息

图3 26批半枝莲UPLC指纹图谱叠加图

表3 半枝莲药材指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积

表4 不同产地半枝莲相似度评价结果

表5 特征值和方差贡献率

表6 初始因子载荷矩阵

用3 个主成分计算半枝莲药材综合得分，结果如表7 所示。整体来看，产自河南的半枝莲材质量相对较优；产自安徽产地的半枝莲药材综合得分排名靠后；产自四川产地的半枝莲排名波动较大，这可能是半枝莲实际情况，质量差异大，也可能因为采样区域性问题，批次较少，缺乏代表性。

图4 不同产地半枝莲的载荷图

表7 26批半枝莲样品的综合得分排序

3 讨论

通过单因素分析，本研究考察了提取溶媒、提取方式及提取时间对半枝莲指纹图谱的影响；考察了半枝莲最佳吸收波长和流动相，确认了半枝莲药材UPLC指纹图谱的供试品处理方法以及最佳色谱条件。

本研究应用质谱共指认了4 个共有峰，它们分别是野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、野黄芩素及芹菜素。根据质谱信息，并结合文献，确定保留时间为25.236 min的色谱峰为木犀草素，推测峰4（保留时间：13.369 min）可能为黄芩素的同分异构体[18]；峰10（保留时间为22.974 min）可能为互为同分异构体的异野黄芩素-8-O-葡萄糖苷、5,8,2'-三羟基-7-O-葡萄糖醛酸黄酮苷或异高山黄芩素-8-O-β-D-葡萄糖苷[19,20]。

从指纹图谱建立的过程中可知，不同产地同一色谱峰的峰高差异较大，这可能与半枝莲的生长环境、地理环境等多种因素有关。因此，选择最适宜生长条件是建立半枝莲药材的基地，控制药材质量的稳定性，生产出高质量中药材的关键环节。