柑橘采后主要病害植物源杀菌剂的筛选及抑菌效果分析

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(1.湖南应用技术学院 农林科技学院，湖南 常德415100; 2.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙410128)

柑橘(Citrusreticulata)是我国南方地区重要的水果之一，具有丰富的营养价值，但柑橘鲜果不耐贮藏，容易发生霉变，极大地降低了其经济效益[1-2]。柑橘采后病害一般以真菌性病害为主，常见的真菌为指状青霉(Peniciliumdigitatum)、意大利青霉(Peniciliumitalicum)、橙酸腐卵形孢菌(Oosporacitriaurantii)及链格孢属(Alternaria)、疫霉属(Phytophthora) 真菌[3-5]。相关研究表明，柑橘采后腐烂主要由绿霉病和青霉病引起，占总腐烂量的80%以上，病菌的侵害导致鲜果贮藏期、货架期短，在造成巨大经济损失的同时还对消费者的健康造成一定的影响，因此，延长柑橘鲜果的贮藏期非常必要[6-7]。目前市场上对柑橘贮藏的主要方式是化学试剂涂抹、熏蒸等，虽然具有一定延长柑橘贮藏期的效果，但化学试剂具有一定毒性和残留，因此，研制出一种无毒、无污染的绿色保鲜剂十分重要[8-10]。如今从植物中寻找天然抑菌活性物质，是开发和研制新型果蔬保鲜剂和杀菌剂的热点之一，许多药用植物提取物能有效抑制果蔬采后病害的发生和病原微生物的生长繁殖，其主要杀菌成分有挥发油类、生物碱类、酚类、酯类、醌类、醚类、黄酮类、皂素类和有机酸类等[11-13]。为此，选择高效低毒、低残留、对环境影响小、不易产生抗药性的植物源杀菌剂进行抑菌效果研究，以期通过开发植物源杀菌剂，有效地控制柑橘采后病害，减少化学杀菌剂的用量，提高柑橘果实贮藏期间的安全性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试植物共有72种，部分购置于湖南九芝堂医药有限公司和湖南养天和大药房，部分常见植物自行采摘。药材经湖南农业大学药用植物资源工程专业的肖深根教授鉴定。植物名称及药用部位列于表1。供试菌种为意大利青霉、指状青霉，由植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室自行分离鉴定。葡萄糖、琼脂粉、丙酮等购自中国医药集团上海化学试剂公司，均为分析纯。主要仪器设备有HVA-85全自动高压蒸汽灭菌锅(上海天呈医流科技股份有限公司)、DSZ2000X倒置生物显微镜(北京中显恒业仪器仪表有限公司)、TGCXZ-5B超声循环提取机(北京弘祥隆公司)、FA2004电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、Buchi R3旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)、DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱(无锡建仪实验器材有限公司)、SR-A10N-50冷冻干燥机(上海舍岩仪器有限公司)、pH计(METTLER TOLEDO公司)、DH5000B 电热恒温培养箱(西安禾普生物科技有限公司)、FW100万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)、LX-600P冷却水循环机(北京长流科学仪器公司)。

表1 供试植物名称及部位Tab.1 Test plant names and parts

续表1 供试植物名称及部位Tab.1 (Continued) Test plant names and parts

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的制备 自行采摘植物经过50～60 ℃烘箱烘干至恒质量，连同所购药材分别打粉过0.15 ～0.30 mm筛，装袋、编号。分别取各植物粉末10.0 g于100 mL洁净的三角瓶中，加入50 mL丙酮提取溶剂，用保鲜膜封口，放入超声仪中800 W、70 ℃提取1.5 h，抽滤，将滤液浓缩后倒入10 mL容量瓶中定容,得到质量浓度为1.0 g/mL的抑菌活性物质，编号，4 ℃冰箱保存备用。另对迷迭香、肉桂、丁香提取物减压浓缩后冷冻干燥至粉末，编号备用。

1.2.2 提取物抑菌效果测定 采用牛津杯法进行抑菌测定[14]。将灭菌后的PDA培养基冷却至45 ℃左右，加入病原菌孢子悬浮液，使孢子最终浓度为105～106个/mL，将混有孢子的PDA培养基快速倒板。取牛津杯插入培养基中0.2 cm，等距放置4个，每个牛津杯中加入100 μL植物提取物(已过膜除菌)，培养皿封口后置于25 ℃培养箱避光培养。每种植物提取物设3个重复，另设丙酮作为空白试剂对照(CK1)，80 μg/mL纳他霉素作为阳性对照(CK2)。培养3 d后用游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.2.3 提取物最低抑菌质量浓度(MIC)测定 将各植物提取物分别与45 ℃左右的PDA培养基混匀，使提取物最终质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。将混有提取物的培养基倒入培养皿中，凝固后加入浓度为105～106个/mL的病原菌孢子悬浮液0.5 mL，用小毛刷涂匀后封口，放置25 ℃培养箱中培养，以丙酮处理作为空白对照。每天观察一次，观察3 d，记录生长情况。

1.2.4 提取物最低杀菌质量浓度(MBC)测定 根据最低抑菌质量浓度，依次提高各提取物浓度倍数与PDA混合，倒入培养皿中，凝固后加菌，涂匀后封口，放置25 ℃培养箱中培养，以丙酮处理作为空白对照。每天观察一次，观察3 d，记录生长情况，确定无菌生长的最低提取物质量浓度。

1.2.5 提取物对病原菌生长抑制率的测定 将迷迭香、肉桂、丁香提取物粉末分别与PDA培养基混合，制成最终质量浓度为3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0(对照)mg/mL的平板，待其凝固后将直径0.9 cm的供试病菌菌饼放置在平板的中央，每皿放置1块，重复3次，将培养皿封口后放置25 ℃培养箱中避光培养4 d。菌丝生长抑制率=(对照菌落净生长距离-处理菌落净生长距离)/对照菌落净生长距离×100%。

1.2.6 提取物对病原菌孢子形成的影响 在6孔板中加入800 μL土豆液体培养基和200 μL孢子悬浮液，使孢子最终浓度为105个/mL，培养10 h，待孢子全部萌发后，将迷迭香、肉桂、丁香提取物粉末分别加入6孔板中，使得提取物最终质量浓度为3.0、2.0、1.0、0.5、0 mg/mL，将6孔板放入25 ℃培养箱，培养3 d，用血球计数板进行计数。

1.2.7 提取物对柑橘果实发病率的影响 取无损伤的宽皮柑橘果实100个，均匀喷洒2种霉菌孢子混合溶液(105～106个/mL)，在常温下贮藏3 d。再用2.0 mg/mL的3种提取液分别均匀喷洒果皮表面，放在阴凉通风处晾干，然后将果实放置于18 ℃、RH 90%的冷库中贮藏，对照喷洒无菌水。每种提取物重复3次试验。每隔10 d测定一次果实的发病率。发病率=发病果实个数/果实总数×100%。

1.3 数据分析

采用WPS 2018软件进行数据处理及图形制作。采用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物提取物的抑菌活性

2.1.1 植物提取物对菌体的抑制效果 不同植物提取物抑菌效果具有较大的差别，如表2所示，有20种植物具有较强的抑菌活性，其中丁香、肉桂、迷迭香、细辛、山苍子、零陵香、凤仙透骨草、广藿香、博落回等抑菌效果突出，抑菌圈直径达到了20～35 mm。从结果可以看出，一般含有较多挥发油的植物具有较强的抑制真菌能力，同时凤仙透骨草、博落回等含有生物碱、醌类、黄酮类的植物也具有一定的抑菌作用。

表2 植物提取物对病原菌菌体的抑制效果Tab.2 Inhibition effect of plant extracts on pathogenic fungi mm

2.1.2 植物提取物对菌体的MIC、MBC值 如表3所示，丁香、肉桂、迷迭香对2种致病菌的抑制效果较好，其MIC值非常低，仅为3.125～6.25 mg/mL，另外抑菌效果较好的还有细辛、山苍子、零陵香、凤仙透骨草、广藿香、博落回、孜然、青蒿等，MIC值在6.25～25 mg/mL。各植物提取物的MBC值明显增大，其中抑菌效果相对较好的是丁香，MBC值为25 mg/mL，可能是粗提物有效抑菌物质含量低或纯度低，以致杀菌的浓度偏高，这与康帅等[15]研究结果相似。

表3 植物提取物对病原菌MIC、MBC的测定结果Tab.3 Determination results of MIC and MBC to pathogens by plant extracts mg/mL

2.2 不同浓度植物提取物对病原菌的抑制效果

2.2.1 不同浓度提取物对病原菌孢子形成的影响 不同提取物对病原菌孢子形成的影响具有一定的差异。如表4所示，采用0.5 mg/mL质量浓度处理时，意大利青霉孢子数在(3.22～4.20)×107个，指状青霉孢子数在(2.85～3.50)×107个，其中丁香处理组抑制效果略好于其余2组。随着各处理组质量浓度的增加，对孢子形成的影响也逐渐加大，当采用3.0 mg/mL质量浓度处理时，孢子数量明显减少，指状青霉孢子数在(0.02～0.22)×107个，较对照降低了95.64%～99.60%，意大利青霉孢子数在(0.20～0.65)×107个，较对照降低了86.84%～95.95%。其中，丁香处理组孢子数最少，指状青霉孢子数仅为0.02×107个。

表4 不同浓度植物提取物对病原菌孢子形成的影响Tab.4 Effects of different concentrations of plant extracts on sporulation of pathogenic fungi ×107个

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

Note： Different lower-case letters in the same column indicated that there was significant difference (P<0.05), the same below.

2.2.2 不同浓度提取物对意大利青霉的抑制率 不同浓度提取物对意大利青霉的抑制效果具有一定的差异。如图1所示，采用0.5 mg/mL质量浓度处理时，抑制率在6.83%～11.01%，随着提取物质量浓度的增加，抑制效果逐渐提高，提取物质量浓度达到2.0 mg/mL时抑菌效果增加较为明显，抑制率达到了50%左右，当采用质量浓度2.5 mg/mL处理时，迷迭香、丁香、肉桂组抑制率分别达到了64.19%、84.64%、72.25%。当提取物质量浓度增加到3.0 mg/mL时，3个处理组的抑制率均达到了85%以上，说明3种提取物均具有较好的抑菌效果。通过回归分析，迷迭香、丁香、肉桂3种提取物的半数抑制质量浓度(EC50)分别为2.43、2.04、2.14 mg/mL。

图1 不同浓度植物提取物对意大利青霉的抑制率Fig.1 The inhibition rate of different concentrations of plant extracts on P.italicum

2.2.3 不同浓度提取物对指状青霉的抑制率 如图2所示，在提取物质量浓度为0.5 mg/mL时，3种植物提取物对指状青霉的抑制率为12.95%～14.59%，随着提取物质量浓度增加，抑制效果逐渐增强，采用2.0 mg/mL质量浓度处理时，抑菌效果有了明显的提高，抑制率达到了60%以上，当采用质量浓度2.5 mg/mL处理时，迷迭香、丁香、肉桂组抑制率分别达到了75.06%、78.02%、79.77%。当提取物质量浓度增加到3.0 mg/mL时，3个处理组的抑制率均达到了90%以上，说明此时指状青霉几乎完全得到了抑制。通过回归分析，迷迭香、丁香、肉桂三者的提取物对指状青霉的EC50值分别为1.79、1.68、1.74 mg/mL。

图2 不同浓度植物提取物对指状青霉的抑制率Fig.2 The inhibition rate of different concentrations of plant extracts on P.digitatum

2.3 不同植物提取物对柑橘果实发病率的影响

采用不同植物提取物处理柑橘果实，每10 d测定一次果实发病率，结果如表5所示。果实贮藏30 d 时对照组果实的发病率达到了23%，3个处理组的果实发病率明显较低，仅为对照组的21.74%～39.13%。对照组果实在贮藏50 d时发病率高达66%，而处理组果实发病率保持在30%左右，说明提取物对柑橘果实具有较好的防腐保鲜作用。在柑橘果实贮藏60 d时，对照组几乎已全部发病，发病率达到了89%，而丁香处理组果实发病率为46%，肉桂、迷迭香处理组分别为52%、57%，相比对照组果实发病率分别减少了48.31%、41.57%、35.96%。3个处理组间，丁香处理组效果略好于肉桂组，肉桂处理组略好于迷迭香处理组。

表5 不同植物提取物对柑橘果实发病率的影响Tab.5 Effects of different plant extracts on the disease incidence of inoculated citrus fruits %

3 结论与讨论

丁香、肉桂、迷迭香、细辛、山苍子、零陵香、凤仙透骨草、广藿香、博落回等植物提取物对柑橘采后主要病害病原菌具有较强的抑菌效果。当提取物的质量浓度增加到3.0 mg/mL时，丁香、肉桂、迷迭香对意大利青霉、指状青霉的抑制率均达到了85%以上，青霉菌得到了有效抑制。柑橘果实分别经丁香、肉桂、迷迭香这3种中药提取物处理后60 d，相对于对照组，果实发病率减少了35.96%～48.31%，但是果实感染真菌后储藏期最好控制在30 d以内。植物提取物可经过进一步完善配方后用于柑橘大规模绿色防腐处理，以延长柑橘的货架期，提高其经济价值。

丁香等部分植物源杀菌剂对柑橘采后病害具有一定的抑菌效果，采用质量浓度为1.0 g/mL的生药处理，抑菌圈直径可达20～35 mm，这些具有较强抑菌作用的中药材提取物中一般含有较多的挥发油物质及生物碱、黄酮和醌类物质，这些植物代谢物可在一定程度上杀灭柑橘采后病原真菌，这与戴素明等[16]、付雯等[17]的研究结果一致。同时，还有个别具有挥发油、黄酮类物质的提取物抑菌效果不是非常好，这可能是因为提取方法不具有针对性，有效成分的提取率不高，或者提取物本身抑菌效果不佳[18]。在后期试验中，可单独对几种或某种抑菌效果好的药材提取物进行分离纯化，从而判定出具体的主要抑菌物质及其抑菌能力。对部分效果较强的中药材进行最低抑菌质量浓度和最低杀菌质量浓度的测定，结果表明，丁香、肉桂、迷迭香的MIC值较低，仅在3.125～6.25 mg/mL，一方面说明提取物抑菌效果较好，另一方面说明这些抑菌较强的植物在柑橘防腐保鲜方面具有较高的利用价值。提取物的MBC值较大，通常远大于MIC值，抑菌效果较好的丁香其MBC值达25 mg/mL，有些具有一定抑菌效果的植物MBC值达到了400 mg/mL，这可能是提取物杂质过多，有些糖类、蛋白质类杂质反而有利于病原菌生长，因此不利于提取物杀菌[19]。

当丁香、肉桂、迷迭香提取物以3.0 mg/mL质量浓度处理病原菌时，菌丝所产生孢子的数量明显减少，指状青霉、意大利青霉孢子数分别减少了95.64%～99.60%、86.84%～95.95%，说明提取物不利于菌丝孢子的形成，阻碍了菌丝的正常生理代谢。通过回归分析发现，迷迭香、丁香、肉桂提取物对意大利青霉菌丝生长的EC50值分别为2.43、2.04、2.14 mg/mL，对指状青霉的EC50值分别为1.79、1.68、1.74 mg/mL，平均EC50值为2.11、1.86、1.94 mg/mL。3种植物提取物的EC50值均较低，抑菌效果较好，这可能是因为这些植物代谢物可改变细胞膜的通透性，破坏细胞结构，影响细胞代谢和分化，扰乱细胞的正常生理功能，从而抑制或杀灭真菌[20-23]。3种提取物对柑橘果实的处理中，在果实贮藏60 d后，对照组柑橘几乎全部腐烂，处理组果实发病率降低了35.96%～48.31%。植物提取物处理组可明显减少果实发病率，一方面是因为提取物杀灭了真菌，另一方面可能是提取物对果实本身具有一定的防腐保鲜作用[24-25]。