塞来昔布对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

段大鹏 秦 静 祁 洁 刘 军 李全义 弓立群

骨肉瘤为青少年儿童最常见的骨科恶性肿瘤，其转移率和病死率高，常规治疗效果不佳[1-3]。有学者发现，应用非甾体类抗炎药能有效降低恶性肿瘤的发生几率[4]。本研究基于既往研究，观察塞来昔布对骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其与PI3K/Akt信号通路之间关系。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

塞来昔布(Celecoxib)购自美国Pfizer公司；人骨肉瘤MG-63细胞株购自上海生命科学研究院细胞资源中心；COX-2、CAS-3和P-Akt抗体购自SantaCruz公司；双抗购自山东鲁抗制药公司；二甲基亚砜(DMSO)、四氮噻唑盐(MTT)等购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养

自液氮中取出人骨肉瘤MG-63细胞，于37 ℃、5%CO2的培养箱内用含15%胎牛血清、100 μg/ml青链霉素的DMEM培养液培养，当人骨肉瘤MG-63细胞贴壁融合度为85%时传代培养。实验选用对数生长期细胞。细胞增殖活性实验MG-63细胞加无血清培养液培养24 h，分别加入含0、25、50及100 μmol/L塞来昔布的培养液。在加药24、48和72 h后，避光加新配制5 mg/ml MTT 20 μL，培养4 h弃培养液后，加DMSO 10 min后，酶标仪检测490 nm处吸光度值，计算细胞生长抑制率。以上实验均重复3次。

1.3 细胞凋亡实验

采用 Annexin V/PI双染色法检测。将MG-63细胞以105/ml细胞密度接种，设0、25、50和100 μmol/l 4个组别。细胞继续培育48 h，调整待测细胞密度为5×105个/ml，1 500 rpm离心5 min，弃上清后依次加入500 μl的1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，室温反应10 min流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4 Western blot法检测COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表达

培养的MG-63细胞同步化后分组干预，收集细胞提取MG-63细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部结束电泳，取下凝胶并作标记，入电转缓冲液平衡5 min后转膜。然后抗原抗体反应。蛋白的表达水平以GAPDH进行标化，通过软件进行灰度扫描并定量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 塞来昔布对MG-63细胞增殖的影响

MTT结果如表1所示，与对照组相比，各实验组细胞生长抑制率随剂量增大而升高，尤以100 μmol/l组最为明显，且与作用时间呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 MG-63细胞生长抑制试验结果

2.2 塞来昔布对MG-63细胞凋亡的影响

通过分析Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测结果发现，实验组凋亡指数显著高于正常对照组，其差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 不同浓度塞来昔布对MG-63细胞凋亡率的影响

2.3 塞来昔布对MG-63细胞COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表达的影响

Western blot结果显示，实验组与对照组比较COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表达水平明显下降,经检验差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 不同浓度塞来昔布对MG-63细胞COX-2、CAS-3和P-Akt蛋白表达的影响

3 讨论

骨肉瘤恶性程度高、预后差，局部和远处转移发生早，治疗效果往往不满意[5-6]。PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，参与细胞生长、增殖及分化调节，在细胞凋亡调控中具有重要地位[7]。在许多肿瘤中，PI3K/Akt信号通路活化，成为抗肿瘤药物耐药的关键靶点[8]。

塞来昔布为特异性COX-2抑制剂，可通过调节细胞内换氧化酶的水平，抑制下游炎症信号分子的转录和表达，而抑制细胞增殖。有研究发现，塞来昔布抑制 Akt 信号通路，可增强sorafenib对肝细胞癌的抗肿瘤活性，提示 Akt是塞来昔布的作用靶点之一[9]。另有研究发现，塞来昔布对多种恶性肿瘤细胞均有抑制和促凋亡作用[10]。

本实验通过不同浓度塞来昔布作用于人骨肉瘤MG-63细胞，发现其可抑制细胞增殖，且呈时间和浓度依赖性。流式细胞术结果显示，不同浓度塞来昔布处理的MG-63细胞出现了明显的凋亡现象。这与国内外相关研究结果一致[11]。

COX-2抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的途径包括COX-2依赖性途径和非COX-2依赖性途径[12]。其中非COX-2依赖性途径抗肿瘤机制目前多家说法不一[13-14]。本实验在观察塞来昔布抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡作用同时,对其机制作了进一步探讨。提示不同浓度的塞来昔布作用于MG-63细胞后，CAS-3和P-Akt蛋白的表达下调，表明其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路有关。

综上所述，塞来昔布对骨肉瘤MG-63细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，其作用机制可能与下调PI3K/Akt信号通路有关。