食管癌细胞中Let-7miRNA表达对CD8+T影响分析

谭 遥 卢 喜 吴万艳 帕力达·阿皮孜阿吉 伊斯刊达尔·阿不力米提

食管癌(esophageal cancinoma)是常见的消化系统恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病第8位，恶性肿瘤死亡的第8位，2017《中国肿瘤年报》报道，食管癌在我国恶性肿瘤的发病率和死亡率均位列第四位，恶性程度极高，严重危害人类健康[1]。Let-7miRNA是目前已知的最大的miRNA家族，以往let-7miRNA被认为是一种抑癌基因[2]，在食管癌细胞中表达水平较低，参与食管癌细胞周期、细胞分裂相关的基因调控，抑制肿瘤血管生成、影响癌细胞的侵袭能力，食管癌中持续let-7miRNA低表达被认为是预后较差的因素之一[3-7]。然而近期的研究提示let-7miRNA可能与细胞免疫功能调节密切相关，Elena等[8]团队发现，let-7miRNA可能是细胞免疫的重要调节分子，T淋巴细胞幼稚状态的维持需要较高水平的let-7miRNA，活化的CD8+T细胞中的表达水平显著减低，通过调整其表达，可以调节CD8+T的增殖和活化。Baer等[9]的团队也发现，降低肿瘤相关巨噬细胞中let-7miRNA的表达可以激活抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤细胞生长。细胞免疫功能下降一直被认为是肿瘤细胞逃避免疫监视的原因之一，免疫治疗也成为近年来的研究热点，其在传统治疗外为肿瘤患者寻找更多的治疗方案。本文通过体外细胞实验，初步探索食管癌细胞中let-7miRNA表达水平对CD8+T细胞活化及功能的影响，结果如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

采用正常食管鳞状上皮细胞系HEsEpiC，食管鳞状细胞癌系Eca109，食管鳞状细胞癌系TE-1。HEsEpiC用含10%胎牛血清的EpiCM培养液，TE-1及Eca109用含10%胎牛血清的DMEM培养液，均在37 ℃、5%CO2恒温培养箱孵育，待细胞生长至80%融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。

1.2 RNA提取及let-7miRNA检测

RNA提取：Trizol试剂提取总RNA，整个操作过程均在冰上进行，提取的RNA分光光度仪测OD值确定RNA质量及完整性。

Let-7miRNA检测：分别取HEsEpiC、Eca109、TE-1总RNA 2 μg，采用let-7和U6(内参)的反转录引物进行逆转录反应，获得cDNA作为模板，荧光实时聚合酶链反应(quantitative Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction qRT-PCR)技术检测let-7miRNA表达。每个样本均设3个平行孔，反应参数为95 ℃预变性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，荧光检测，反应40个循环。并绘制溶解曲线，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以2-△△ct法来计算正常食管鳞状上皮细胞系与食管鳞癌细胞系中的let-7miRNA表达量比值。

1.3 Let-7miRNA表达差异对CD8+T细胞激活影响

1.3.1 外周血单个核细胞提取 5名健康志愿者空腹抽取肘静脉外周血5 ml，肝素钠抗凝，密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC)，置于10% 胎牛血清(FBS) 1640培养液中，5%CO2，37 ℃孵育箱中备用。

1.3.2 Let-7inhibitor、Let-7mimic细胞建立 提前一天将TE-1细胞接种于12孔板，1×105个/孔；转染前，弃去培养基，加入800 μl Opti-MEM培养基；13 μl转染试剂Hyperfect 2000及2.5 μg 质粒或mimic、NC、inhibitor(50 nM)加入到含200 μl Opti-MEM的RNase free中，漩涡振荡混匀，室温静止10～15 min；将混和液加入到12孔板中，细胞培养箱中培养6 h；更换培养基，37 ℃5% CO2孵育48 h。

1.3.3 共培养体系CD8+T细胞活化及效应因子检测

取TE-1、let-7inhibitor、let-7mimic与PBMC共同培养反应体系各100 μl(1∶50，24 h)。采用FITC anti-human CD8a Antibody、PE anti-human CD71 Antibody、PE anti-human CD69 Antibody表面染色4 ℃孵育20 min，洗涤2次，离心，去上清；100 μl PBS和300 μl 4%多聚甲醛，4 ℃固定25 min；破膜液破膜、离心，去上清，PBS洗涤2次，PE anti-human IFN-γ Antibody、PE anti-human Perforin Antibody，4 ℃避光孵育30 min，洗涤2次；PBS制备细胞悬液，BD FACSCalibur检测。

1.4 统计分析

Let-7miRNA表达以均数±标准差表示，差异采用Graphpad Prism6，Demo软件进行统计分析，CD8+T细胞CD71，CD69，IFN-γ,Perforin差异分析采用Florjo 7.6.1软件分析，所有实验均重复3次。

2 结果

2.1 Let-7miRNA表达差异

分别检测HEsEpiC、Eca109、TE-1 细胞中let-7miRNA转录水平，HEsEpiC(16.11±2.073)，Eca109(1.67±0.912)、TE-1(1.01±0.123)，Eca109、TE-1肿瘤细胞let-7miRNA表达水平均显著低于正常食管上皮细胞(P=0.007，0.000)，食管癌细胞株的let-7miRNA处于低表达状态(图1)。

图1 HEsEpiC、Eca109、TE-1 细胞中let-7miRNA表达

2.2 Let-7miRNA表达对CD8+T细胞活化影响

细胞转染法干扰TE-1细胞系let-7miRNA表达，不同表达组分别于PBMC共同培养24 h，检测不同培养系中CD8+T细胞活化相关分子CD69、CD71表达，Control与inhibitor未见显著差异(P=0.058,0.160)、inhibitor与mimc组，control与mimc组间，CD69、CD71表达差异存在显著差异(P=0.003，0.007和P=0.000，0.001)(图2、3)，食管癌细胞中let-7miRNA表达水平与CD8+T细胞活化能力呈正相关，能促进CD8+T细胞的激活。

图2 Let-7miRNA表达水平对CD8+T CD69表达影响

图3 Let-7miRNA表达水平对CD8+T CD71表达影响

2.3 Let-7miRNA表达对CD8+T细胞效应影响

分别取let-7miRNA表达共培养体系，检测不同培养系中CD8+T细胞效应相关产物干扰素-γ(IFN-γ)，穿孔素(Perforin)的表达，IFN-γ在mimic组中的表达高于对照组和抑制组(P=0.023，0.001)，在三组中为最高；模拟组中穿孔素也显著高于其他两组，抑制组中IFN-γ、穿孔素表达均为3个中最低(P=0.006，0.000)(图4)。食管癌肿瘤细胞中的let-7miRNA表达水平可以影响CD8+T细胞效应分子分泌，进而影响CD8+T细胞杀伤功能。

图4 Let-7miRNA表达水平对CD8+T分泌IFN-γ，Perforin的影响

3 讨论

食管癌是最常见的消化系统肿瘤之一，在发展中国家发病率显著高于发达国家，2013年全球死于食管癌的为440 000人[1]。我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一，年平均死亡率为14.59/10万[10]。目前食管癌的治疗仍以手术、放疗、化疗为主，经过几十年的改进，疗效仍不尽如人意，晚期食管癌的5年总生存率(overall survival,OS)徘徊在15%～20%之间，根治性的放疗、同步放化疗等治疗手段在一定程度上改善了预后，5年0S提高至40%～47%[11-12]。新的治疗途径，尤其是免疫治疗的兴起，让我们看到了食管癌治疗的希望，目前已经有将PD-1、PD-L1用于食管癌治疗的临床实验，有望改善食管癌的预后[13-15]，对新的免疫调节点的研究也从未停止过。

Let-7miRNA作为1个古老的RNA家族，人们一直在探索其功能，既往的研究主要集中于其抑癌的作用方面，认为其在肿瘤中存在低表达的情况，在乳腺癌、肺癌中的表达水平可能与预后直接相关，食管癌中的持续低表达可能提示预后不良[4-5,16-17]。在肿瘤分发生和发展过程中，let-7miRNA靶向调节的癌基因在成熟的组织中不表达或者低表达，但在肿瘤形成过程中出现表达或者表达升高。在白血病和前列腺癌的研究中又得到了不同的结果[18]。除此之外，也有研究提示let-7miRNA调控的靶基因产物高迁移率蛋白A1,A2(high mobility group A1,A2 HMGA1,HMGA2)与肿瘤的迁移能力密切相关，在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤中存在显著高表达状态[7,19-20]。同时，let-7miRNA也可以通过调整细胞周期蛋白D2(cyclinD2，CCND2)使肿瘤细胞停止在G1/S阶段。在不同类型肿瘤的发生发展中作用机制不尽相同，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化的过程[21]。近期的一些研究欣喜的发现let-7miRNA在细胞免疫方面也有作用，Zhang等[22]报道let-7miRNA可以调节CD62-L、CD69表达，从而影响CD8+T细胞的迁移能力。Elena等[8]则发现，维持幼稚的淋巴细胞状态，需要高水平的let-7miRNA表达，细胞成熟后表达则显著降低，通过改变CD8+T细胞中let-7miRNA的表达水平，可以观察到其增殖、分化和功能的变化，let-7miRNA可能是CD8+T细胞免疫调节的潜在位点，进一步的研究也发现这种调节机制可能是激活Eomes的靶基因实现的。

本研究检测了较为常见的食管癌Eca109、TE-1细胞株中的let-7miRNA的表达水平并与正常食管上皮细胞HEsEpiC进行比较，证实其在食管癌细胞中的低表达。进一步选取表达水平居中的TE-1，采用细胞转染的方法改变其let-7miRNA表达水平，并与志愿者PBMC共同培养，通过检测与CD8+T细胞活化相关的CD69、CD71，杀伤功能相关的IFN-γ，Perforin的水平[23],初步分析食管癌细胞中let-7miRNA表达对CD8+T细胞的影响。结果显示，let-7miRNA水平的升高可以促进CD8+T细胞的活化并提高其细胞杀伤功能。let-7miRNA高表达组培养体系中CD8+T中细胞CD69、CD71及IFN-γ，Perforin的表达水平显著高于对照组和低表达组，低表达组的相应细胞因子及效应分子则明显降低，提示其表达与CD8+T细胞的活化和功能水平呈正相关。这一现象与let-7miRNA调节CD8+T细胞激活和功能的研究结论相似，提示食管癌细胞中let-7miRNA表达水平降低可能是其在肿瘤形成过程中逃逸机体免疫监视的途径之一。也间接的印证了持续低表达的食管癌患者预后差的可能原因，由于本研究是在体外细胞水平进行，有一定的局限性，进一步在食管癌患者组织标本及血液标本中检测let-7miRNA的表达水平，并研究其相关的靶基因和细胞通路分子在患者体内的表达情况，有望更加深入的揭示其作用机制。

本研究通过体外细胞实验初步探讨了let-7miRNA表达对细胞免疫的影响。在食管癌细胞中，let-7miRNA的表达水平与CD8+T细胞活化和杀伤功能呈正相关。Let-7miRNA可能是食管癌患者细胞免疫的潜在调节位点之一，值得进一步深入研究。