静原鸡ELOVL5基因遗传多样性研究

张 娟，母 童，赵 平，陈佳萍，冯小芳，郭 鹏，武泽文，刘丽元，蒋秋斐，顾亚玲，*

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021； 2.彭阳县畜牧技术推广服务中心，宁夏 固原 756500)

静原鸡又名固原鸡、静宁鸡，主要分布于宁夏南部地区，是国家畜禽资源保护品种之一，现以彭阳县数量最多，质量最优。彭阳县地属温带半干旱大陆季风性气候，因此静原鸡兼顾耐干旱、易放牧、抗逆性强等优点，且肉质鲜美、细嫩，氨基酸、脂肪酸含量高、胆固醇含量低，是鸡肉中首选的绿色营养保健食品[1]。近年来，越来越多的人开始关注膳食营养，对肉品质的要求更是如此。脂肪酸含量是肉品质评价的重要指标之一，有研究表明，鸡肉的营养价值、风味与脂肪酸的组成和含量密切相关[2]。经研究发现，静原鸡中含有丰富且对人体有特殊营养价值的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[3]。极长链脂肪酸延伸酶蛋白家族(elongation of very-long-chain fatty acids，ELOVLs)最早来源于酵母ELO家族(ELO1、ELO2、ELO3)，是长链脂肪酸(C16、C18)和超长链脂肪酸(≥C20)合成的起始酶和限速酶[4]。直至目前，共发现7种蛋白家族成员(ELOVL1-7)，分别参与延长不同长度的脂肪酸链，对脂肪酸的代谢进行调控，进而发挥其生物学功能[5]。ELOVL5基因全长897 bp，定位于人体6号染色体，共编码299个氨基酸，主要参与单不饱和脂肪酸(C16、C18)和多不饱和脂肪酸(C18、C20、C22)的合成[6-7]，并且调控肝脏、脂肪及碳水化合物的代谢，从而影响血脂、血糖浓度[8]。ELOVL5基因在静原鸡肝脏中的表达量最高，其他部位也均有表达，其编码的脂肪酸还与人体糖尿病、眼病、炎症性肠疾病及许多其他疾病有关[9-11]。Matsumoto等[12]研究发现，ELOVL5基因与肉牛背膘厚存在显著相关。郭鹏程等[13]研究表明，ELOVL5基因启动子序列SNP7(g.-385C>G)中GG基因型、GA基因型与尿素氮、校正奶量显著相关。目前，国内外大多数研究报道都集中在鱼类及ELOVLs家族与人类众多疾病之间的关系研究[14-18]，在鸡上的报道极少。

本研究以宁夏地方优良品种静原鸡为研究对象，利用PCR-SSCP及DNA测序技术对静原鸡ELOVL5基因遗传多样性进行检测，为后期挖掘与肉质相关的位点提供基础资料，并为我国地方品种鸡的种质资源遗传评定及地方品种分子育种的技术平台构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

随机选取彭阳县朝那鸡繁育中心第五世代150日龄静原鸡248只，采用一次性真空采血管翼下静脉采血3～5 mL，-20 ℃保存备用。

1.1.2 设备

B-120自动颗粒制冰机购自太仓市华美生化仪器厂；电子天平购自梅特勒-托利多中国地区；PCR仪、微量移液枪、低温高速冷冻离心机均购自德国Eppendorf公司；WD-9406型胶片观察灯、DYY-6C型电泳仪均购自北京市六一仪器；凝胶数字成像系统购自时代联想生物科技有限公司；微波炉购自格兰仕微波炉电器有限公司等。

1.1.3 试剂

Tris-平衡酚，蛋白酶K，6×loading buffer，琼脂糖，1×TAE均购自北京索莱宝科技有限公司；2×PowerTaqPCR MasterMix，DL2000 DNA Marker均购自北京百泰克生物技术有限公司；丙烯酰胺(Acr)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、去离子甲酰胺均购自Ameresco公司；Tris购自MP生物医疗公司；四甲基乙二胺(TEMED)、无水乙醇均购自天津市北联精细化学品开发有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取及检测

采用苯酚氯仿抽提法提取鸡血液中的基因组DNA，用TE缓冲液溶解。将提取出来的DNA通过0.8%的琼脂糖凝胶检测并拍照保存。合格DNA样品于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR引物设计及合成

根据NCBI上提供的原鸡ELOVL5(登录号：NC_006090.4)基因序列，通过Primer Premier 5.0软件设计引物(引物序列见表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增

PCR扩增反应总体系为20.0 μL：灭菌超纯水7.4 μL，模板0.8 μL(50～100 ng·μL-1)，上下游引物各0.4 μL(10 pmol·L-1)，2×PowerTaqPCR Master Mix 11.0 μL(5 U·μL-1)。静原鸡ELOVL5基因exon2、intron2和exon5 PCR扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，退火温度见表1，72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 8 min。PCR扩增产物检测：取3.0 μL扩增产物，上样于1%琼脂糖凝胶，以DL 2 000 DNA Marker作为对照，100 V电压15 min，凝胶成像仪观察检测结果。

表1ELOVL5基因引物及扩增区域

Table1The primer and amplified region forELOVL5 gene

基因Gene扩增区域Amplified regions引物序列Primer sequences(5′-3′)退火温度Tm/℃产物长度Product length/bpELOVL5Exon2F: GAGTATCTGTCTGCAATTTTTGT50.3262R: TTTCTTATGCTCTAGTGTGTGTTIntron2F: TTGAAGGTCATCAAGTCGAACTGCA59.7304R: GCAAATCTGTTTATCAAGGGCTACGExon5F: TGTGGGAAGGTGTGGTGATGA56.9350R: GGCCTCTGATGCAAGCATATC

1.2.4 PCR-SSCP检测

取2.0 μL PCR扩增产物，加入8.0 μL变性缓冲液，含980 μL去离子甲酰胺，20 μL 0.5 mol·L-1EDTA，少量溴酚蓝和二甲苯青蓝(一般7～8 μL)，混匀，98 ℃变性10 min，冰浴10 min。将变性后的PCR产物，上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=29∶1)，电泳条件见表2。

1.2.5 产物测序

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分型，挑取不同带型对应的扩增产物送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.6 数据统计分析

通过BioEdit软件进行序列比对，找出突变位点。运用Popgen软件计算基因型频率、等位基因频率、纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和卡方值，利用PIC软件计算多态信息含量。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

静原鸡全基因组DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示，其条带清晰明亮，无拖带。通过紫外分光光度计测其D260/D280为1.6～1.8，无DNA降解，没有蛋白、外源核酸及其他杂质污染，可以用于后续试验。

2.2 PCR扩增结果

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后3对引物分别得到1条清晰且单一、与目的片段大小一致的片段，且无引物二聚体及非特异性条带，可进行后续SSCP分析，结果见图2。

表2ELOVL5基因PCR-SSCP电泳条件

Table2Electrophoresis conditions of PCR-SSCP forELOVL5 gene

基因Gene扩增区域Amplified regions预电泳Pre-electrophoresis高电压High voltage电泳ElectrophoresisELOVL5Exon2250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 11 hIntron2250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 14 hExon5250 V, 30 min250 V, 10 min100 V, 20 h

1～9，不同个体的DNA样。1-9, DNA samples from different individuals.图1 静原鸡全基因组DNA提取Fig.1 The genomic DNA extraction of Jingyuan chicken

2.3 PCR-SSCP检测结果

如图3所示，将3对引物对应的PCR产物分别进行SSCP检测，结果在ELOVL5基因 exon2和exon5扩增片段上分别检测出一种带型。在ELOVL5基因intron2扩增片段上共检测到2种带型，分别为AA和AG。随机取不同带型的2个PCR产物回收纯化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

M， DL2000 DNA marker；1～18， 不同个体的PCR样品。M, DL2000 DNA marker; 1-18, PCR samples from different individuals.图2 ELOVL5基因各位点PCR检测结果Fig.2 Detection of PCR products in ELOVL5 gene

图3 ELOVL5基因各位点SSCP检测结果Fig.3 Detection of SSCP in ELOVL5 gene

2.4 等位基因序列比对分析

与NCBI公布的原鸡ELOVL5基因序列(NC_006090.4)进行比对，发现静原鸡ELOVL5基因exon2和exon5引物扩增片段均无多态性，基因序列与原序列均一致，结果如图4、图5所示。静原鸡ELOVL5基因intron2引物扩增片段多态性是由内含子区的核苷酸点突变造成的，等位基因序列比对如图6，其中等位基因A存在g.88620433+1683G>A的转换。

图4 ELOVL5基因exon2 等位基因序列比对Fig.4 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene exon2

图5 ELOVL5基因exon5等位基因序列比对Fig.5 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene exon5

图6 ELOVL5基因intron2等位基因序列比对Fig.6 The alleles sequence alignment of ELOVL5 gene intron2

2.5 ELOVL5基因SNPs位点遗传特性分析

ELOVL5基因intron2遗传多态性分析见表3和表4。在静原鸡ELOVL5基因intron2中基因A为优势等位基因，基因频率为0.92。基因型AA为优势基因型，基因型频率为0.84。在248个静原鸡群体中没有发现含纯合GG型的个体。群体遗传学分析表明：该位点纯合度较高，为0.84，PIC为0.14(PIC<0.25)，呈低度多态。卡方适合性检验结果表明，静原鸡ELOVL5基因intron2突变未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表3ELOVL5基因内含子2等位基因频率和基因型频率

Table3Allele frequency and genotype frequency ofELOVL5 gene intron 2

基因型个数频率等位基因频率GenotypeNumberFrequencyAlleleFrequencyAA2080.84A0.92AG400.16G0.08

表4ELOVL5基因内含子2遗传多态性参数

Table4Genetic polymorphism parameters ofELOVL5 gene intron 2

多态性位点遗传多态性参数静原鸡PolymorphismGenetic polymorphism parametersJingyuan chickenELOVL5基因第2内含子纯合度Homozygosity(Ho)0.84ELOVL5 intron2杂合度Heterozygosity(He)0.16有效等位基因Effective number of alleles(Ne)1.17多态信息含量Polymorphism information content(PIC)0.14卡方值Chi-Square(X2)1.86

3 讨论

生物体遗传多样性主要由于其生存环境及病原体压力驱动导致基因水平上的差异所致[19]。Matsumoto等[12]研究表明ELOVL5基因g.-110T>C是肉牛育种一个有用的遗传标记。ELOVL5基因intron5多态性还与鲤鱼体重增加显著相关，可以将EOLVL5延伸酶基因可作为鲤鱼分子育种的候选基因[20]。Shi等[21]在山羊乳腺上皮细胞中通过下调或过表达ELOVL5基因，三酰甘油的含量不会改变，突出了ELOVL5基因在反刍动物乳腺中16C和18C不饱和脂肪酸延伸中的重要作用。ELOVL5基因还参与蛋鸡中N-3和N-6长链多不饱和脂肪酸的生物合成[22]。本研究运用PCR-SSCP技术对静原鸡ELOVL5基因的遗传多样性进行检测，结果发现ELOVL5基因exon2和exon5扩增片段均未发生碱基突变，无多态性，表明静原鸡ELOVL5基因exon2和exon5的遗传性状比较稳定，也可能由于此区域曾发生过变异，但由于该个体对当时的环境不够适应以及自身抗病、耐寒等方面存在缺陷，而逐渐被自然或人为淘汰。同样，母童等[3]在静原鸡ELOVL2基因exon6扩增片段上也未发现突变位点，说明静原鸡在遗传进化上趋于稳定。与原鸡ELOVL5基因序列比对后发现在静原鸡ELOVL5基因intron2扩增片段上仅存在g.88620433+1683G>A的转换，该位点的突变可能在静原鸡肉质方面及抗旱耐寒等优良性状的基因表达调控方面具有一定作用，具体机制还有待后续进一步研究。

动物群体内的个体间差异主要与遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)等有关，遗传变异越大，选择的潜力就越大。在静原鸡ELOVL5基因intron2扩增片段上共检测到2种基因型，分别为AA、AG，纯和度(0.84)远高于杂合度(0.16)，表现纯合子优势，因此在环境中的表现型趋于稳定。本研究248个静原鸡群体中没有发现含纯合GG型的个体，可能由于长期的自然选择而被淘汰。静原鸡的PIC值为0.14(PIC<0.25)，属低度多态。卡方适合性检验结果表明静原鸡ELOVL5基因intron2突变未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，说明这个位点保守性较高，可能受当地群众长期人工选育的影响。