智能治疗仪对兔膝骨关节炎软骨结构和关节液IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA 含量的影响

林 洁 ，许惠凤 ，陈 俊 ，叶锦霞 ，郑春松 ，王丽丽 ，张世茂 ，吴广文

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建省祥兴电子科技有限公司，福建 宁德 352300）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是中老年人常见的关节疾病之一，临床症状表现为疼痛、僵硬、活动受限等，严重影响患者的生活质量［1-2］。随着医学的快速发展，KOA的病因、机制等相关研究取得了一定进展，但治疗上仍未有突破性成果［3-4］。本研究拟观察智能治疗仪对兔KOA关节软骨组织的形态变化、蛋白多糖及关节液中白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）-3、透明质酸（hyaluronic acid，HA）的影响，探究智能治疗仪对KOA的作用及可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 新西兰大白兔64只，体质量为（2.1±1.0）kg，雌雄各半，购于上海松联实验动物场，许可证号：SCXK（沪）2012-0011。饲养于福建中医药大学动物实验中心的普通级医学实验动物环境。

1.2 实验试剂 戊巴比妥钠（美国Sigma公司）；HE染色试剂盒（北京索莱宝生物有限公司）；改良番红O-固绿试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）；IL-1β试剂盒、IL-6试剂盒、TNF-α试剂盒、MMP-3试剂盒、HA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器 智能治疗仪（福建省祥兴电子科技有限公司）；G6805-2A低频电子脉冲治疗仪（上海华谊医用仪器有限公司）；生物组织自动脱水机、生物组织石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；全自动石蜡切片机、光学显微镜（德国Leica公司）；多功能酶标仪（瑞士TECAN公司）。

2 实验方法

2.1 造模 采用随机数字表法将64只新西兰大白兔随机分为空白组（n＝16）和造模组（n＝48）。适应性喂养 1周后，造模组采用改良 Hulth法［5-6］建立KOA模型，空白组未进行任何操作。术后对造模组肌肉注射20万单位青霉素，每日2次，连续注射3 d。术后1周，强迫所有动物进行活动30 min，每日1次，连续8周或16周。

2.2 分组及干预 采用随机数字表法将造模组分为模型组、对照组和治疗组各16只。干预在改良Hulth手术后1周进行，每组随机分2批，干预时间分别为8周和16周。对照组予低频电子脉冲治疗仪干预，每次30 min，每日2次；治疗组予智能治疗仪干预，每次30 min，每日2次；空白组和模型组均不进行任何治疗。

2.3 动物取材和标本制备 干预8周和16周后，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉兔子，麻醉成功后，用5 mL医用注射器针头于髌韧带附着点外上方处穿刺入关节腔内，注入灭菌盐水1.5 mL后反复活动膝关节30次，抽取关节液，置入EP管中，－80℃保存备用。打开膝关节腔，取胫骨平台外侧软骨组织，快速置于4%中性多聚甲醛中固定2 d，经过10%EDTA-2NA脱钙2个月，再进行梯度酒精脱水、二甲苯和石蜡置换，用石蜡进行包埋。取胫骨平台内侧软骨组织，在低温环境下修成约1 mm×1 mm×3 mm大小，经过前固定、后固定、树脂包埋和聚合形成电镜标本。

2.4 软骨组织病理 将包埋块切成4 μm的切片，贴附于粘附载玻片，置于60℃烘箱过夜。HE染色：经过二甲苯、梯度酒精脱蜡入水后，置于苏木素染液 1 min，蒸馏水漂洗5 min，伊红染色 1 s，蒸馏水漂洗5 min。改良番红O-固绿染色：脱蜡入水后用Weigert染液（现配现用）染色5 min，酸性乙醇分化15 s，再用固绿染液染色5 min后蒸馏水洗1 min，用番红O染色3 min，蒸馏水洗1 min。乙酸溶液分色2 min，蒸馏水洗30 s后，将切片晾干，中性树脂封片。置于光学显微镜下观察并记录软骨组织形态及蛋白多糖含量。

2.5 电镜观察 树脂包埋块以1 μm进行半薄切片定位后，再以90 nm进行超薄切片。超薄切片进行醋酸铀-柠檬酸钻染色后，置于透射电镜下观察big记录软骨组织超微结构。

2.6 软骨组织Mankin’s评分 根据HE染色和改良番红O－固绿染色的光镜结果，参照Mankin’s评分标准［7］进行评估软骨组织病程变化。Mankin’s评分标准为：软骨组织结构（正常0分、表面不平整1分、裂隙达移行层2分、裂隙达辐射层3分、裂隙达钙化层4分、软骨脱落5分）；软骨细胞数量（正常0分、增多1分、成簇状2分、减少3分）；改良番红O-固绿染色（正常0分、轻度失染1分、中度失染2分、重度失染3分、完全失染4分）；潮线（完整0分、多重1分、软骨下骨血管入侵潮线2分）。

2.7 关节液 IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA 含量测定 取出－80℃保存备用的关节液，按照试剂盒说明书步骤，检测不同时间点各组兔关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA 含量。

2.8 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料符合正态分布，数据以（）表示；不符合正态分布的数据以中位值（第一四分位数，第三四分位数）表示。计量资料符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布，组间比较采用秩和检验。

3 结 果

3.1 实验完成情况 本实验对象原为64只新西兰大白兔，在实验过程中因造模麻醉过量致死1只和因腹泻致死2只。

3.2 软骨组织显微结构 软骨组织HE染色和改良番红O-固绿染色见图1～2，8周和16周的空白组：关节软骨表面光滑，浅表层、移行层、辐射层、钙化层4层结构清晰可辨，软骨细胞排列规则，潮线完整，软骨基质浅紫红色。8周和16周的模型组：关节软骨表面粗糙，软骨层变薄，4层结构紊乱，细胞呈簇状且数量减少，潮线多重或不完整或完全消失，软骨下骨侵入软骨层，软骨基质番红O染色严重失染。8周和16周的对照组和治疗组关节软骨表面稍不规则，4层结构仍可区分，软骨细胞数量增多或呈簇状，潮线复制，软骨下骨有侵入软骨组织倾向，软骨基质番红O染色失染表现。各组软骨组织在8周的显微结构情况较16周好。

3.3 软骨组织不同干预时间Mankin’s评分比较见表1。

3.4 软骨组织超微结构 8周和16周的空白组：软骨细胞形状规则，周围见有胞突，粗面内质网、高尔基体、线粒体丰富，糖原散在分布，胶原原纤维较细且密集。8周和16周的模型组：软骨细胞形状较不规则，周围胞突减少，胞核变性，粗面内质网扩张成池或减少，高尔基体、线粒体固缩不易识别，糖原减少，部分细胞呈变性、坏死状态，胶原原纤维减少。8周和16周的对照组和治疗组：软骨细胞形状稍不规则，粗面内质网、线粒体及高尔基体结构较模型组好，糖原稍减少，胶原原纤维稍稀疏。

3.5 不同干预时间关节液中 IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA的含量比较 见表2。

4 讨 论

KOA 属中医“痹证”“痿证”范畴［8］。KOA 的治疗方式多样，其中包括了电刺激物理治疗，智能治疗仪正是属于其中一种［9］。智能治疗仪在神经电理论基础上研发而来，治疗时结合中医经络穴位理论，通过对相关穴位的刺激以达疏经通络、行气活血之功，从而达到治疗KOA的作用。

图1 软骨组织HE染色图（×100）

图2 软骨组织改良番红O-固绿染色图（×50）

表1 软骨组织不同干预时间Mankin's评分比较

KOA的病理变化包括软骨组织退变、软骨下骨硬化、骨赘增生、滑膜炎症、周围韧带松弛、肌肉萎缩等，其中最核心病理特征为软骨组织退变［10-11］。尽管骨关节炎（osteoarthritis，OA）曾被认为是一种非炎性疾病，但是炎症反应存在于疾病进程中已越来越被认可［12］。HA是关节滑液成分之一，具有润滑、滋养、缓冲压力等作用，有研究报道KOA患者滑液中HA浓度明显降低，其降低的原因可能与炎症、滑膜异常等密切相关［13-14］。现较为明确的是，除力学刺激外，相关生物分子参与KOA病理发生发展中，如 IL-1β、IL-6、TNF-α、MMPs 等［15］。 细胞因子由多种细胞分泌，且具有调节和介导免疫和炎症的作用，参与 OA 的发生发展中［16］，如 IL-1β、IL-6、TNF-α均在OA患者滑液中表达增加且与病情程度呈正相关［17-18］。在OA中，IL-1β能刺激软骨细胞、滑膜细胞生成MMPs、一氧化氮、前列腺素E等，IL-6影响软骨细胞和滑膜细胞增生且刺激IL-1、MMPs形成，TNF-α参与软骨与骨的损伤且促进前列腺素E、MMPs等生成，三者均参与炎症反应过程［19-20］。MMP是多种具有相似结构蛋白酶构成的大家族，可分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素等，能降解细胞外基质的各种成分，与OA疾病密切相关［21］。例如，MMP-3可直接降解多种胶原、蛋白多糖、纤连蛋白等，在OA的关节液、血清、软骨中能检测到MMP-3 表达增高［22-24］。

本实验结果表明改良Hulth法建立兔KOA模型较为稳定，软骨组织退变明显，手术后16周的软骨组织损伤情况对比8周明显加重。智能治疗仪和电子脉冲治疗仪均能改善软骨组织退变，抑制蛋白多糖降解，在干预8周时，两者治疗效果相当，但是在干预16周时，智能治疗仪的效果优于电子脉冲治疗仪。与治疗8周相比，治疗16周后，模型组、治疗组和对照组中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MMP-3含量均进一步升高，HA含量进一步降低，表明关节炎仍然处于进展过程，但对照组和治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-3含量升高幅度与HA降低幅度均低于模型组，说明智能治疗仪和低频电子脉冲治疗仪虽无法完全阻断KOA疾病进程，但可起到延缓疾病进程的作用。同一疗程中，治疗组与对照组IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-3 与 HA 的含量比较不存在差异，说明智能治疗仪在调节这些分子的作用与低频电子脉冲治疗仪相当。另外，因智能治疗仪携带、使用方便，有利于随时随地使用，值得临床进一步推广。

表2 不同干预时间关节液中IL-lβ、IL-6、TNF-α、MMP-3、HA含量比较ng／mL