石斛合剂对糖尿病模型大鼠内脂素及血糖的影响

王 林，施 红，张捷平，郑雪花，王晓宁

（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

研究发现2型糖尿病患者表现为慢性低度炎症反应，而慢性炎症的发生与糖尿病过程中多种炎症因子，尤其是脂肪细胞因子表达分泌紊乱有密切关系。脂肪细胞因子不仅在脂肪组织表达分泌，在其他靶器官如肝脏、肾脏中也有表达，在正常情况下参与血糖、血脂水平的调节和代谢，其表达分泌异常在糖尿病的发生及病情的进展发挥重要作用［1-2］。脂肪细胞因子内脂素（visfatin）是糖尿病发病与病情进展的重要相关细胞因子［3］。目前研究认为其是糖尿病发生的独立相关因素，也在糖尿病并发症包括肝脏损害、糖尿病肾病的发生与进展中扮演了重要作用。我们采用石斛合剂治疗2型糖尿病患者，发现其有降低血糖、调整血脂、改善胰岛素抵抗、促胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌、促胰岛β细胞增殖的作用［4-6］，对糖尿病慢性炎症反应有改善作用，对糖尿病时靶器官有保护作用［7-9］。本研究通过观察石斛合剂对糖尿病模型大鼠visfatin表达的影响，分析其对糖尿病时慢性炎症状态改善作用及对靶器官保护作用的机理。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠30只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005，合格证号：0073141，饲养于福建中医药大学实验动物研究中心。

1.2 实验药物和试剂 石斛合剂（组方包含石斛、生地黄、黄芪、丹参）由福建中医药大学国医堂提供；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；微量血糖检测仪及血糖检测试纸（上海复旦大学张江生物医药股份有限公司）；Trizol试剂、M-MLV Reverse Transcriptase逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；Perfect Real Time-SYBR Premix EX Taq Kit实时定量PCR试剂盒（大连宝生物有限公司）；visfatin ELISA检测试剂盒、抗体（英国Abcam公司）；免疫印迹RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；甘油三酯（TC）、总胆固醇（TG）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20170430、20170515）。

1.3 实验设备 Stratos高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技中国公司）；DU730分光光度计（美国Beckman Coulter公司）；Gel Doc XR凝胶电泳成像检测分析系统（美国Bio-Rad公司）；DYY-6C双稳定时电泳仪（北京市六一仪器厂）；ULT-1386-5V超低温冰箱（赛默飞世尔科技中国公司）；Epgradient S实时荧光定量PCR仪（德国Eppendorf基因有限公司）；BIO-RAD蛋白电泳仪器［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］；快速血糖检测仪（德国 Roche公司）；Beckman X20自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）。

2 实验方法

2.1 石斛合剂药液制备 石斛、黄芪、丹参、生地黄等中药水煎。购买药材加入1000 mL蒸馏水中，浸泡30 min，大火煮沸10 min后，小火煎煮20 min，滤出药液。水煎2次，所得药液混合后浓缩，浓缩至1.2 g／mL生药量浓度。

2.2 动物造模 SPF级健康成年雄性SD大鼠30只，体质量（200±20）g，适应性喂养 1 周，自由摄食摄水，采用简单随机抽样抽签法，选取6只为正常组，余24只为造模组。正常组进食普通混合饲料，造模组进食高脂高糖饲料（配方为普通混合饲料88.5%、猪油10%、胆固醇 1%、胆酸钠0.5%）。饲养4周后造模组禁食12 h，鼠尾采血检测血糖后，予链脲佐菌素腹腔注射，用量为30 mg／kg体重，注射后喂食普通混合饲料。注射后第3天，禁食12 h，鼠尾采血测血糖，空腹血糖水平≥11.1 mmol／L为糖尿病模型大鼠。其中1只死亡，4只未成模，成模19只。

2.3 动物分组及给药 选取12只造模组大鼠随机分为模型组和石斛合剂组各6只，石斛合剂组予石斛合剂药液按 12 g／（kg·d）进行灌胃，模型组和正常组予等量生理盐水灌胃，共灌胃干预8周。

2.4 取材 末次给药后次日禁食，鼠尾取血，血糖检测仪快速检测血糖。30%乌拉坦腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心后分离血清，4℃备用。检测血生化指标及血清visfatin水平。取大鼠内脏脂肪组织、肝脏、肾脏液氮保存备用。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 血清学指标检测 检测3组大鼠空腹血糖及血清中TG、TC含量，并采用ELISA法检测血清中visfatin水平。

2.5.2 组织visfatin mRNA表达水平检测 取大鼠内脏脂肪、肝脏、肾脏组织样本各30 mg，以液氮碾磨后采用Trizol试剂提取各组织总RNA。检测各样本提取RNA的OD260／OD280比值，分析计算总RNA纯度和浓度。每样品取5 μg总RNA，使用qRTPCR试剂盒采用 Oligo（dT）20引物进行逆转录，合成cDNA。应用Prime5.0软件设计引物，visfatin：正向引物5'-TCTGGAAATCCGCTCGACAC-3'，反向引物5'-AGTAAGTTCCCCTGCCTCAC-3'，扩增片段长度129 bp。 β-actin：正向引物 5'-ATTGTGATGGACTCCGGAGA-3'，反向引物5'-CTCGTCAGGATCTTCATGA-3'，扩增片段长度136 bp。反应体系：2×SYBR 12.5 μL，10 μmol／L 正向、反向引物各 0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O补至体积 25 μL。 反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；55～60 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s；共45个循环。融解曲线分析：温度60～95℃，每个样本重复实验检测3次。以β-actin作为内参，以相对表达量2-△△Ct来表示目的基因mRNA的相对表达水平。

2.5.3 组织visfatin蛋白表达水平检测 取大鼠内脏脂肪、肝脏、肾脏各样本组织30 mg，加入液氮碾磨，采用RIPA裂解液裂解后提取蛋白，BCA法检测各样品上清液蛋白浓度。取50 μg蛋白，经10%SDS-PAGE凝胶电泳，电转印至硝酸纤维素膜，室温以5%脱脂牛奶封闭。加入一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，以TBST洗膜，加入碱性磷酸酶标记的二抗（1∶2 000）室温孵育 2 h，充分洗涤后显影。 以βactin作为内参，采用美国Flour ChemV 2.0凝胶成像分析软件，扫描蛋白电泳条带的灰度值，进行定量分析，结果以目的蛋白灰度／内参β-actin灰度比值表示。

2.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用（）表示，组间比较采用One-Way ANOAY方差分析。相关性分析采用Pearson简单相关分析。

3 结 果

3.1 3组大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比较 见表1。血清visfatin水平与血糖水平相关性分析，结果见图1。Pearson相关分析显示r＝0.767，P＝0.002，血糖水平与血清visfatin水平呈正相关。

表1 3组大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比较（）

表1 3组大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比较（）

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常组模型组石斛合剂组鼠数666空腹血糖 ／（mmol／L）5.06±0.85 30.31±3.561）18.41±5.531）2）TG／（mmol／L）0.85±0.09 1.92±0.211）1.46±0.151）2）TC／（mmol／L）1.13±0.16 2.23±0.311）1.61±0.201）2）血清 visfatin／（pg／mL）137.17±10.94 210.67±22.321）168.52±15.631）2）

图1 血清visfatin水平与血糖水平关系散点图

3.2 3组大鼠不同组织visfatin mRNA表达水平比较 见表2。

3.3 3组大鼠不同组织visfatin蛋白表达水平比较见图 2、表 3。

表2 3组大鼠不同组织visfatin mRNA表达水平比较（）

表2 3组大鼠不同组织visfatin mRNA表达水平比较（）

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常组模型组石斛合剂组n666内脏脂肪1.02±0.09 4.40±0.511）2.41±0.791）2）肝脏1.02±0.14 2.53±0.551）1.57±0.281）2）肾脏0.96±0.10 2.04±0.521）1.59±0.191）2）

图2 3组大鼠不同组织visfatin蛋白表达电泳图

表3 3组大鼠不同组织visfatin蛋白表达水平比较（）

表3 3组大鼠不同组织visfatin蛋白表达水平比较（）

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正常组模型组石斛合剂组n666内脏脂肪0.38±0.11 0.85±0.111）0.53±0.141）2）肝脏0.43±0.09 0.64±0.121）0.45±0.091）2）肾脏0.51±0.80 0.74±0.141）0.52±0.171）2）

4 讨 论

传统医学认为糖尿病早期发病机理是阴虚燥热。阴津亏耗致燥热偏盛，燥热盛则阴津虚，两者互为因果。如不及时恰当治疗，病程迁延阴损耗气，而致气阴两虚。脏腑功能失调，津液代谢障碍，气血运行受阻，痰浊瘀血内生，全身脉络瘀阻，脏腑器官失去气血滋养引起多器官病变。若病程迁延日久或因治疗失当，阴损及阳，终致阴阳俱虚。石斛合剂滋阴清热、益气活血，兼以疏肝解郁、清肝泄浊，能解除病况中的阴虚、气虚、血瘀状况，改善脏腑状态。前期的研究证实其能显著调整血糖、血脂水平［4-6］。

visfatin是一种与血糖调节有关的重要细胞因子，在人和动物的脂肪细胞、肝细胞、骨骼肌、肾脏等均有表达，其可通过提高脂肪和肌肉组织葡萄糖摄取能力，降低肝糖原的释放来影响血糖水平，调节糖代谢。还能直接与胰岛素受体结合，激活胰岛素调节脂肪细胞糖代谢的相关信号通路，有类胰岛素样作用［10］。近年来不少研究证实，visfatin与糖尿病之间有着密切的关系。Alghasham等［11］研究发现，无并发症的糖尿病患者血visfatin含量明显高于非糖尿病组和有并发症的患者。Chen等［12］用酶免法测量了61名糖尿病患者和 59名健康对照者血浆visfatin含量，结果发现：与正常人对比，糖尿病患者血浆visfatin含量显著升高，且与体脂含量成正相关，提示visfatin的表达与血糖水平改变及机体脂肪代谢有关，这可能是调节机体糖代谢稳态的重要机制之一，在糖尿病的发生发展过程中起重要作用。

本实验以糖尿病模型大鼠为研究对象，观察石斛合剂灌胃后大鼠内脏脂肪、肝脏、肾脏中visfatin的水平变化。检测到石斛合剂组与模型组比较，组织中visfatin表达量显著下降，且与血糖变化水平呈现正相关，说明石斛合剂可以改善多组织中的visfatin的表达，达到降糖效果，其作用具有多环节、多靶器官特点。另外目前研究认为2型糖尿病是由炎症因子介导的慢性炎症反应性疾病，visfatin也是重要的促炎症因子，其在糖尿病慢性炎症发展过程中也起重要作用［13］。石斛合剂降低组织中visfatin的表达可改善组织器官慢性炎症状态，提示了石斛合剂对糖尿病慢性器官病变的作用，而慢性炎症状态与血糖水平的变化将是接下来研究的内容。本研究为石斛合剂降糖作用及其对靶器官的保护作用提供了理论支持。