慢性HBV携带小鼠模型评估

袁慧鑫，郭子宁

（北京中医药大学东方医院，北京 100078）

2015年国家卫计委发布的信息显示：我国的慢性HBV感染者约有9 000万人，其中约2800万人为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者［1］。 一般认为，非活动HBV携带状态较CHB更少进展为肝硬化、肝癌；但有研究显示相比于健康人群，慢性携带者出现肝组织病变甚至肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的概率并不低［2］；而且在非活动性HBsAg携带者中约有20%～30%可出现自发HBV再活动［3］，年发生率约 1%～3%［4］。 尽管当前的抗病毒药物能有效抑制HBV复制，但仍面临HBsAg清除率极低、安全停药难、耐药等问题［5］。所以消灭乙肝仍然是现今医学研究的重要内容。HBV感染具有明显的种属限制，目前应用于实验研究的小鼠和细胞株均是通过转基因技术获得的［6］。转基因小鼠对HBV的相关抗原具有免疫耐受性，处于免疫耐受状态［7］，而慢性HBV携带者的免疫系统亦对HBV特异性无应答。课题组通过转基因小鼠模型的生化指标、肝组织病理等与慢性HBV携带状态的相似度，以期评估该模型是否适用于慢性HBV携带状态的相关研究。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级环境饲养的C57BL6J-TgN（Alb1HBV）44BriHBV转基因小鼠，购自北京大学医学部实验动物科学部；于1998年2月自美国Jackson Laboratory引进，其转入的基因片段为HBV ayw亚型的S基因、preS基因以及X基因［8］。

1.2 实验试剂 ALT、AST生化试剂盒［英科新创（厦门）科技有限公司］；HBsAg、HBeAg 试剂盒（美国雅培公司）；Trizol（美国英杰生命技术有限公司）。

1.3 实验设备 5417R型台式低温高速离心机（Eppendorf公司），AU480型全自动生化仪（日本奥林巴斯株式会社），I2000型化学发光免疫分析仪（美国雅培）；ABI 7900 qPCR仪（美国应用生物系统公司）。

2 实验方法

2.1 实验分组 模型组为雄性转基因8～12周龄10只，对照组为同品系正常小鼠10只，体质量18～22 g。饲养24周后取材，饲养过程中模型组死亡3只，对照组无死亡，统计时于对照组中随机选取7只小鼠数据进行对比观察。取材前禁食水12 h，眼眶取血法取血，静置 1～2 h，10 000 r／min室温离心10 min，分离血清后保存于－20℃。断颈椎处死小鼠，75%酒精消毒小鼠尾部，剪取约1 cm，-80℃保存，75%酒精消毒腹部并备皮后打开腹腔，暴露肝脏组织，剪取肝脏后用生理盐水冲净，滤纸拭干，置于4%多聚甲醛液中充分固定。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 肝组织HBV DNA检测 预冷研体，-80℃中取出样本，加液氮研磨为粉状，采用TRIzol提取总RNA，按逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，－20℃保存备用。 反应体系：cDNA 2 μL、qPCR mix 10 μL、primer F 1 μL、primer R 1 μL、ddH2O 6 μL。 反应条件：95 ℃ 2 min、94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s做40个循环。引物模板序列，HBV：primer F TGGTGT CTTTTGGAGTGTGGAT，primer R TAACATTGAGAT TCCCGAGATTG；β-actin：primer F GCCCTGAGGCT CTCTTC CA，primer R GCGGATGTCGACGTCACA。

2.2.2 血清指标 使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中的AST、ALT含量；使用化学发光免疫分析仪检测小鼠血清中的HBsAg、HBeAg含量。

2.2.3 肝组织HE染色 肝脏组织经脱水、石蜡包埋后，沿横断面连续切片制成厚度0.4 μm切片；进行HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理形态并摄片，评估病变程度。

3 结 果

3.1 2组HBV DNA表达比较 模型组小鼠均有HBV DNA表达，见表1。

表1 2组HBV DNA表达比较

3.2 2组HBsAg、HBeAg表达比较 模型组小鼠血清HBsAg、HBeAg表达率均为100%。见表2。

表2 2 组 HBsAg、HBeAg 表达比较（）

表2 2 组 HBsAg、HBeAg 表达比较（）

注：与对照组比较，1）P＜0.05。

组别对照组模型组HBeAg 0.560±0.106 1.606±0.3761）n77 HBsAg 0.017±0.008 112.219±88.4041）

3.3 2组ALT、AST水平比较 见表3。

表3 2 组 ALT、AST 水平比较（）U／L

表3 2 组 ALT、AST 水平比较（）U／L

注：与对照组比较，1）P＜0.05。

组别对照组模型组AST 46.429±4.577 62.857±5.7281）n77 ALT 39.143±2.911 62.857±3.4371）

3.4 肝组织病理 光镜下对照组小鼠肝组织未见明显病理改变；模型组小鼠肝细胞排列欠规整，部分肝细胞胞质呈伊红均染（毛玻璃样变性），局部可见巨核肝细胞，肝内散在肝细胞坏死伴淋巴样细胞浸润，肝窦内可见淋巴样细胞聚集灶。

图1 2组小鼠肝组织HE染色图（×100）

4 讨 论

同种转基因小鼠的前期相关研究提示：该转基因小鼠ALT、AST等生化指标较同品系正常小鼠明显升高，且与周龄呈正相关［9］；此模型小鼠肝脏局部可见肝细胞肿胀、毛玻璃样变性、灶性坏死伴淋巴样细胞浸润等病理表现，免疫组化分析提示HB-sAg在肝细胞质沉积［10］；有研究认为肝细胞的炎症、坏死与HBsAg滞留进而影响肝细胞正常代谢有关［11］。关于 ALT、AST血清水平与肝组织变化，本实验结果与上述研究相同。

关于慢性HBV携带者肝组织病理的临床研究提示：慢性携带者有90.2%存在一定程度的肝组织病变［12］，病变程度与血清 ALT、AST、HBV-DNA 及HBVM（乙肝病毒标志物）水平均无相关性［13］；而肝纤维化程度随年龄增长加重［14］。

本实验模型小鼠表达的HBV相关抗原来自受精卵时期的转入基因，该基因整合于小鼠的染色体，可稳定表达，模型小鼠对HBV相关抗原无免疫应答，这点符合慢性HBV携带状态特点。模型小鼠的肝组织出现损伤，但损伤程度并不重，而临床上慢性HBV携带状态者肝亦有不同程度的损伤。模型小鼠的肝损伤或许由HBsAg沉积所致，但是否存在自发免疫耐受被打破，进而出现免疫损伤的可能？若是自发激活，或许可借此了解慢性HBV携带状态患者HBV再活动机制，从而为临床干预提供支持。小鼠是继人类之后第二个完成基因测序工程的哺乳动物，遗传背景明确［15］，为进行相关基因调控等研究提供了可能性。综上所述，课题组认为本实验采用的C57BL6J-TgN（Alb1HBV）44BriHBV小鼠适用于慢性HBV携带状态相关研究。