树鼩脊髓星形胶质细胞的分离鉴定

王 璇， 王文广， 李 娜， 袁 园， 张志成， 孙晓梅

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队，云南省眼科疾病防治研究重点实验室， 昆明 650118)

哺乳动物中枢神经系统(CNS)的功能复杂性取决于在发育过程中产生不同细胞类型的能力，而星形胶质细胞是哺乳动物CNS中分布最广、含量最多的细胞，其在形态和功能上具有多样性[1]。星形胶质细胞在CNS发育过程中主要负责众多的营养功能[2]， 是构成血-脊髓屏障和血-脑屏障的重要组成部分， 在维持CNS稳态、神经损伤修复、神经退行性疾病[3-4]、癫痫[5]、神经发育Rett综合征及脆性X智力低下[6]等疾病中发挥重要作用。另外， 运动神经元的正常发育、维持以及神经元相关的疾病都涉及神经元与神经胶质细胞间复杂的相互作用。建立这些细胞的原代培养方法是理解其相互作用的关键步骤，也将为开展病原如何通过血-脊髓屏障的机制研究提供重要材料。星形胶质细胞的体外培养方法已有报道，所用动物多为鸡[7-8]和鼠类[9]，且多为脑组织来源， 只有少数研究从脊髓中分离[10]。

树鼩是一种新型的实验动物，与非人灵长类亲缘关系接近，其生理、生化、基因组和解剖学等生物学特性比啮齿类更接近于人类，且大脑较发达，已被用于神经系统相关疾病的研究[11-13]，但迄今尚未见到关于树鼩脊髓源星形胶质细胞分离培养相关报道。因此，探索一种操作简便、经济可行的原代星形胶质细胞分离培养方法，对开展树鼩星形胶质细胞的相关研究和丰富其实验材料具有一定现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新生1～2 d的树鼩，雌雄不限，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供[SCXK(滇)K2013-0001]，实验操作在医学生物学研究所树鼩种质资源中心实验设施进行[SYXK(滇)K2013-0001]。

1.1.2 主要仪器与试剂 A/B3(6Ft)生物安全柜、CO2T/C 恒温培养箱均购自美国Forma公司; ECLIPSE Ti倒置显微镜购自日本Nikon公司; L8-80M 超速离心机购自美国Beckman公司; ZD-85 数显恒温振荡器购自中国金坛市精达仪器制造厂; PBS、DMEM/F12 培养基均购自美国Hyclone公司; 胎牛血清(FBS)购自中国Excell Bio公司; 胰蛋白酶购自美国Gibco公司); D-Hank’s液、DNase Ⅰ均购自中国索莱宝公司; Poly-D-lysine购自美国Sigma公司; 鼠抗人胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体、Cy3标记的羊抗鼠荧光二抗均购自英国ABCam公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓原代星形胶质细胞分离 取3只新生1～2 d树鼩， 腹腔注射过量质量分数2%戊巴比妥实施安死术， 于体积分数75%的酒精中消毒3 min。将树鼩置于冰袋上，使用无菌剪刀从树鼩背侧近尾端剪开， 慢慢分离去除脊柱两旁的肌肉组织， 获得完整的脊柱，然后于超净台上取出脊髓组织， 置于预冷的含体积分数2%双抗的D-Hank’s液中。在解剖镜下用镊子和剪刀小心去除脊髓外膜和较大的血管， 然后在预冷的D-Hank’s液中漂洗3～5次。用无菌剪刀将洗净的脊髓组织剪碎约1 mm3大小，加入1 mL体积分数0.25% 的EDTA-胰蛋白酶中并轻轻吹打30 s。于 37 ℃消化 10 min， 消化至 5 min 时轻摇一次，消化结束后立即加入等量含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，然后加入1 mL DNaseⅠ(60 U/mL)， 吹打混匀，以 75 μm 的细胞筛过滤。滤液转移至15 mL离心管中于4 ℃、1 000 r/min离心8 min，弃上清，用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液重悬，接种于普通的T25培养瓶中， 在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养30 min，然后轻轻翻转培养瓶，将液体转移至已包被右旋旋多聚赖氨酸(质量分数0.1%)的培养瓶中，放入培养箱中继续培养， 每2 d换液1次。

1.2.2 星形胶质细胞纯化培养 原代培养至10 ～15 d， 显微镜下观察到细胞长满培养瓶后， 于 37 ℃、280 r/min恒温摇床振荡18 h，倒掉培养液，用PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化3 min，细胞回缩至50%的细胞脱落后，加入等体积的含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化，用移液器吹打混匀， 1 300 r/min 离心 5 min， 弃上清，加入含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液，制成细胞悬液，接种于普通的T25培养瓶中，在37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养30 min， 翻转培养瓶，将液体转移至已包被右旋多聚赖氨酸的培养瓶中， 放入培养箱中继续培养。连续3次重复纯化。

1.2.3 星形胶质细胞形态学观察 取原代培养和经纯化培养的星形胶质细胞，用倒置显微镜观察细胞形态及生长状态，并拍照记录。

1.2.4 星形胶质细胞免疫荧光鉴定 取24孔板， 在中间8个孔中加入细胞爬片， 并将第3代细胞接种于孔中; 将孔板中已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次，每次2 min; 质量分数4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次2 min; 0.5%Triton X-100室温穿孔20 min; PBS漂洗玻片3次， 每次2 min; 5%的山羊血清室温封闭30 min; 山羊血清， PBS漂洗3次，每次2 min; 滴加稀释好的抗GFAP一抗(1∶400稀释)，对照孔加PBS代替一抗，4 ℃过夜孵育; PBS漂洗4次，每次3 min; 避光条件下， 分别加入相应的荧光二抗，37 ℃孵箱1 h; PBS漂洗4次，每次3 min;滴加DAPI避光孵育2 min，PBS清洗3次，每次2 min; 吸走液体， 加入抗荧光淬灭剂(1∶500 稀释)，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5 MTT法测定星形胶质细胞生长曲线 纯化培养后，选取单层生长的细胞制成细胞悬液; 培养液稀释细胞浓度至5×104细胞/mL， 以每孔100 μL接种于96孔培养板中， 设1～8 d共8组，每组5个复孔， 空白调零组为不接种细胞只加培养液; 于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养，分别在培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d后， 小心吸去培养液， 每孔加入培养液180 μL 和MTT 20 μL; 继续培养4 h，去除培养液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃下溶解15 min，选择波长490 nm，以空白组调零，在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值。

2 结果

2.1 形态学观察

原代分离的未贴壁细胞呈圆形， 折光性较强。接种10 min就可见少量细胞开始贴壁，30 min后杂细胞已经贴壁，而大部分星形胶质细胞还处于悬浮状态，此时将培养液小心转移至经右旋多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，8 h后大部分细胞已贴壁;培养至3 d，细胞表面开始长出突起; 培养至8 d，细胞数量明显增多，胞体变得膨大，少数呈现扁平状，细胞突起更加明显，呈放射状分布于胞体周围; 培养13 d，细胞长满培养瓶(图1)，可见细胞基本分为两层， 下层细胞是星形胶质细胞，细胞折光性较弱，胞体呈暗色，突起更加明显且交织成网状结构; 上层分布着少量突起较少、胞体较小的细胞，可能是少突胶质细胞，另外也存在极少数折光性较强，胞体小而明亮，具有两条长突起，呈串珠状生长的细胞，可能是神经元。经多次纯化及传代培养后，神经元和少突胶质细胞明显减少，此时的星形胶质细胞多为不规则的细胞形态(图2)。

2.2 细胞免疫荧光染色

GFAP是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，定位于胞质中的骨架蛋白，常用于星形胶质细胞鉴定。我们对分离培养的细胞进行GFAP免疫荧光染色，结果显示GFAP阳性细胞激发红色荧光，细胞核为蓝色。未经纯化传代的细胞中存在少量GFAP阴性的杂细胞，此时的星形胶质细胞形态以多突起为主，还有少量为多角状及形态不规则。经过3次纯化后，获得的星形胶质细胞纯度达到95%，此时的星形胶质细胞主要以多角状和不规则状为主，长突起细胞则明显减少(图3)。

2.3 树鼩星形胶质细胞生长曲线

生长曲线结果显示，在培养1 d、2 d细胞增殖相对较慢，而在3 d、4 d增殖最快，5 d时细胞增殖达到顶峰，且在显微镜下观察到细胞已长满培养板底部。此后，细胞增殖变缓，细胞数量逐渐减少。根据每日测得的A490，取平均值作生长曲线(图4)。因此，可以选择传代培养3 d、4 d的星形胶质细胞开展实验，此时细胞处于对数生长期，细胞活力最强。

图1 原代培养的树鼩脊髓星形胶质细胞Figure 1 Morphology of primary cultured astorcytes derived from tree shrew spinal

图2 经三次纯化培养后的树鼩脊髓星形胶质细胞Figure 2 Spine astrocytes morphology after three times purification and culture

图3 GFAP免疫荧光染色结果Figure 3 Results of immunofluorescence staining of GFAP

图4 MTT法测定的星形胶质细胞生长曲线Figure 4 The growth curve of astrocytes[dx4] by MTT method

3 讨论

树鼩作为与灵长类动物相近的动物， 已被用于很多感染性模型研究中， 包括乙型肝炎病毒[14，15]、丙型肝炎病毒[16，17]、单纯疱疹病毒[18，19]、流感病毒[20]、肠道病毒[21-23]。实验室早期研究[21]表明，树鼩感染EV71后，部分树鼩出现了急性松弛性瘫痪， 并有尿潴留症状， 组织病理学检查发现在脑部伴随有相应的病理变化，我们推测EV71病毒可能透过血-脊髓屏障，对运动神经元造成损伤，出现急性迟缓性麻痹。而星形胶质细胞是血-脊髓屏障的重要组成部分，因此，分离树鼩脊髓星形胶质细胞对研究EV71致树鼩急性迟缓性麻痹具有现实意义。此外，来源于其他物种的星形胶质细胞已被用于癫痫、阿尔茨海默症、柯萨奇病毒感染[24]、EV71感染[25]、流感病毒感染[26]、HCMV感染[27]研究中，而树鼩来源的脊髓星形胶质细胞或许能够更好地阐明这些疾病和病毒感染的机制。

目前，星形胶质细胞的体外分离培养主要来源于动物的脑组织，而鲜有脊髓来源的星形胶质细胞分离培养的文献报道。常用的星形胶质细胞体外分离培养方法主要为胰蛋白酶消化法，结合差速贴壁和恒温摇床振荡，以分离得到一定纯度的细胞。体外分离培养的星形胶质细胞中的成纤维细胞是主要的污染细胞[28]，此外，还有少突胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞的污染。

我们参考国内外已有的星形胶质细胞体外分离培养方法[10，29-30]，并加以改进。首先，选用新生1～2 d树鼩作为实验材料。由于星形胶质细胞的分裂增殖高峰发生在动物胚胎晚期及出生后[31，32]，此时脊髓膜还未成熟，容易分离干净，能够减少成纤维细胞污染，且脊髓内血管未发育成熟，可以减少血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的污染。为减少体外分离培养的星形胶质细胞中的成纤维细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞的污染，我们的经验是在解剖获得脊髓后，于解剖显微镜下尽量去除脊髓外膜和大的血管。我们预实验表明，相比于使用成年树鼩(一岁以上)，使用新生1～2 d乳树鼩进行细胞分离时脊髓外膜更容易去除干净， 分离获得的星形胶质细胞纯度更高， 可传代次数更多。其次， 脊髓组织经EDTA- 胰蛋白酶与DNaseⅠ联合充分消化后，经过细胞筛过滤获得单个细胞，去除大血管段和组织块; 利用成纤维细胞和小胶质细胞贴壁速度明显快于星形胶质细胞的特点， 对原代细胞进行连续多次差速贴壁处理，可有效降低成纤维细胞和小胶质细胞的污染，但同时会损失部分星形胶质细胞; 待细胞长满后通过恒温摇床振荡去除贴壁性弱于星形胶质细胞的少突胶质细胞;连续3次纯化可以去除分裂能力较弱的神经元。

我们观察到，在原代分离获得的未纯化细胞中，形态主要以星形为主，具有较多的突起，胞体较平滑呈圆形。经过纯化和传代培养后，星形细胞逐渐减少，多角状形态不规则的细胞明显增多，而免疫荧光鉴定结果也显示为星形胶质细胞，这符合星形胶质细胞的形态多样性。

通过此方法获得的脊髓源性星形胶质细胞纯度能够满足后续实验要求。细胞生长曲线实验结果提示，在体外培养3 d、4 d细胞快速增值，5 d达顶峰，相比于大鼠来源的星形胶质细胞，生长曲线趋势基本一致，但生长到达平台期的时间提前了1 d[33]。本文实验结果为脊髓星形胶质细胞相关疾病的研究提供了又一体外模型。