猫泛白细胞减少症病毒环介导等温扩增检测方法的建立

马 芹， 闫文卓， 周 洁， 高 诚， 刘铁龙， 赵丽丽， 陈洪岩， 陆涛峰

(1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所， 哈尔滨 100193;2. 上海实验动物研究中心， 上海 201203;3. 河南省济源市动物卫生监督所， 济源 454650)

猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus，FPV)，又称猫瘟热病毒，属于细小病毒科，细小病毒属，该病毒为单链DNA病毒，基因组全长约5 200 nt，编码VP1、VP2 两种结构蛋白，其中VP2蛋白为主要衣壳蛋白， 是FPV的主要免疫保护性抗原蛋白[1，2]。FPV感染范围较广，可感染猫科、鼬科及浣熊科动物，如猫、狮、虎、豹等[3]; 该病毒传播较快，可通过感染动物的粪便、尿液及呕吐物进行水平传播， 妊娠母猫可垂直传播给胎儿。FPV致病性较强， 可导致妊娠母猫流产或产畸形胎，死亡率高且无任何病前征兆[4]。目前该病的检测主要依赖于病毒分离及血清学诊断，这些方法耗时长，成本高，不适用于临床样品的快速检测。随着动物园猫科动物、宠物猫的养殖量增多，同时，许多医药研究也需要实验用猫，对猫的疫病监测及防控需高度重视，建立一种适于临床检测FPV的快速检测方法迫在眉睫。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)技术是一种新型的核酸扩增技术，该技术依赖具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，利用4条特异性引物在等温条件下扩增出LAMP特有的梯状条带[5，6]。LAMP技术特异性好、检测快速、操作简单，已在禽流感病毒[7]、猪繁殖与呼吸综合征病毒[8]、猪细小病毒[9]及猪流行性腹泻病毒[10]等方面成功建立了快速检测方法。本研究旨在利用LAMP技术建立一种检测FPV的高效、快速、特异性的检测方法，用于FPV的早期诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与样品 FPV，猫疱疹病毒(FHV)，犬细小病毒(canine parvovirus， CPV)及犬腺病毒(canine adenovirus， CAV)由本实验室保存; 疑似FPV感染猫临床样品来自上海猫养殖基地。

1.1.2 主要仪器和试剂 EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTap SuperMix 购自北京全式金生物技术有限公司， AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 购自美国Axygen公司， pMD18-T载体购自宝生物(大连)工程有限公司，朗报®脱氧核糖核酸扩增试剂盒和荧光目视检测试剂盒购自荣研生物科技有限公司，K-8D型电热恒温水槽购自上海精宏实验有限公司，凝胶成像分析系统购自北京赛智创业科技有限公司，其他常规试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank上FPV的VP2基因保守序列，应用Primer 5.0软件设计一对引物，序列为FPV- F： 5'-TGTAACACCTTGGTCATT-3';FPV- R： 5'- ATTCATCACCTGTTCTTA-3'，目的片段为467 bp，用于PCR扩增。同时，利用 PrimerExplore V4 软件(http：//primerexplorer.jp/e/)针对PCR扩增序列设计LAMP扩增引物，序列为F3： 5'-TGCATCATTGATGGTTGC-3'; B3： 5'-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3'; FIP： 5'-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3'; BIP： 5'-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATC ATCTGGATCTGTAC-3'，引物均由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA的提取 FPV， FHV， CPV， CAV按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书提取DNA。

1.2.3 PCR扩增及阳性质粒构建 构建PCR扩增体系 50 μL： SuperMix 25 μL，模板 2 μL， 引物 FPV- F和引物 FPV- R(10 μmol/L)各 1 μL，重蒸 H2O 补足50 μL。94 ℃ 预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，35 个循环; 72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段经测序分析以验证扩增片段是否正确。切胶回收PCR产物，连接pMD18-T载体，构建阳性重组质粒。

1.2.4 LAMP检测方法的建立与优化 以提取的FPV DNA为模板，利用引物F3、B3、FIP及BIP按照LAMP试剂盒和荧光目视检测试剂盒说明书构建LAMP反应体系，设置阴阳性对照，在恒温水浴条件下进行反应。优化LAMP反应温度，分别为60℃，63℃，64℃，65℃; 同时优化LAMP反应时间，设置为30 min，45 min，60 min，反应结束后，可直接目测结果，阴性样品为橘黄色，阳性样品为荧光绿色，或扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳在凝胶成像系统下分析结果。

1.2.5 LAMP的敏感性检测 利用紫外分光光度计测定构建的阳性重组质粒浓度，换算成病毒拷贝数。将质粒10倍系列稀释进行PCR和LAMP敏感性检测，比较两种方法的敏感性。

1.2.6 LAMP的特异性检测 以构建的最佳LAMP反应条件对FPV、FHV、CPV及CAV进行扩增，产物直接目测或经2%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，验证该方法的特异性。

1.2.7 临床样品检测 将来自上海的10份疑似FPV感染猫全血样品，5 000×g离心3 min，取血清，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书提取病毒基因组，利用本实验建立的LAMP方法和PCR方法进行检测和结果比较分析。

2 结果

2.1 PCR扩增

通过对PCR扩增退火温度的优化， 显示在46 ℃，48℃，50℃，52℃，54℃，56℃下均可扩增出单一条带(图1)，初步确定最佳退火温度为56℃并进行下一步试验。扩增片段经克隆测序分析，结果表明扩增得到的片段为FPV VP2基因。

2.2 LAMP扩增条件的优化

图1 PCR扩增退火温度优化Figure 1 Annealing temperature optimization of FPV PCR

通过设置不同反应温度，优化LAMP扩增条件，结果表明，在60℃、63℃、64℃和65℃恒定水温下均能扩增出典型的“梯形”条带，阳性对照也呈“梯形”条带，阴性对照未扩增出条带，说明LAMP反应体系成立。其中，当反应温度为65 ℃，条带最清晰(图2)，因此确定最佳的LAMP反应温度为65℃。

通过设置不同的反应时间，优化LAMP扩增条件，结果表明，反应时间在30 min，45 min和60 min条件下也均可扩增出典型“梯形”条带。其中， 当反应时间为60 min时，条带最清晰(图2)，因此确定最佳的LAMP反应反应时间为60 min。

图2 LAMP扩增条件的优化Figure 2 Optimization of the FPV LAMP

2.3 LAMP的敏感性检测

结果表明，原始阳性质粒的拷贝数为5.01×1010拷贝/μL。分别以10倍系列稀释的阳性质粒作为LAMP和PCR扩增模板， 扩增结果显示， LAMP检测的最低拷贝数为5.01×102拷贝/μL(图3A)，而PCR最低检测拷贝数为5.01×103拷贝/μL(图3B)，表明LAMP检测方法的敏感性比PCR方法高10倍。

实验过程中使用荧光目视检测试剂盒，因荧光染料含有钙黄绿素，在LAMP反应初期因与锰离子结合而处于荧光猝灭状态，随着LAMP反应的进行，钙黄绿素逐渐恢复游离发出荧光，可实时地进行肉眼观察或将扩增产物置于凝胶成像系统下观察，均可明显区分阳性和阴性，目测时阳性呈绿色，阴性为橘黄色; 在凝胶成像系统下，阳性有明亮的荧光，阴性为透明色或较浅的颜色(图3C)。

2.4 LAMP的特异性检测

图3 PCR和LAMP敏感性分析Figure 3 Sensitive analyze of PCR and LAMP assays

选择临床上猫易感的4种病毒FPV、FHV、CAV及CPV进行特异性检测。以提取FPV、FHV、CAV、CPV的DNA为模板，分别配制LAMP反应体系，在65℃反应60 min，对LAMP反应的结果进行检测，结果表明，只有FPV的LAMP扩增产物呈现特异的阶梯状条带，其它模板未扩增出条带(图4A)，加入荧光染料后，可观察到FPV的LAMP扩增产物显现明亮的荧光，而其它样品为透明色或较浅的颜色，为阴性(图4B)。

2.5 临床样品检测

采集10份疑似FPV感染猫血清临床样品，提取DNA样品，利用本实验建立的LAMP和PCR检测方法同时对10份样品进行检测，结果显示LAMP检出3份阳性，PCR检出3份阳性(图5)，两种方法阳性符合率100%。

图4 LAMP特异性分析Figure 4 Special analyze of LAMP assays

图5 PCR和LAMP临床样品检测Figure 5 Evaluation of PCR and LAMP assays with clinical samples

3 讨论

猫泛白细胞减少症是由FPV引起的一种急性、高度接触性、致死性传染病，主要发生在幼龄猫科动物，以高热、呕吐为主要特征[11]。近年来，猫作为宠物，饲养量快速增加，而宠物携带的疫病传播迅速，引起了较多的负面影响。随着宠物猫在公共场合出现更为频繁，增加了宠物疫病如猫瘟热潜在传播流行的风险。LAMP检测方法具有相对简便、快捷、特异、灵敏度高及肉眼观察等优点， 在临床兽医方面有巨大的潜力。从Notomi等[5]研发LAMP技术，到Nagamine等[12]在LAMP方法中补充2条环状引物，提高了反应速度，缩短了反应时间，在60～65 ℃等温条件下水浴加热60 min可完成目的基因的扩增，使得LAMP技术已被应用于各种病原体的早期检测。LAMP的反应过程为先由外侧引物扩增出一段模板，再由内侧引物与模板互补扩增靶基因片段，由于靶基因序列与内侧引物存在反向互补序列，通过杂交形成颈环结构，进过反复循环扩增得到扩增产物，在琼脂糖凝胶电泳中呈现不等大小的梯形扩增产物[13]。

本研究通过对LAMP反应温度和反应时间的优化，确定了最佳的反应条件，在65℃恒定水浴条件下反应60 min后，80℃ 10 min将酶失活，终止反应，可直接目测颜色反应，也可经2%琼脂糖凝胶电泳，表明扩增条带较为明亮和清晰，并且建立的LAMP检测方法，可成功检测到FPV，而FHV、CPV和CAV为阴性，该方法特异性较好。LAMP检测的灵敏度达到5.01×102拷贝/μL， 比常规PCR的敏感性高10倍。与PCR扩增相比，LAMP方法具有以下优点： (1)不需要设置一系列温度，只需要设置一个反应温度和一个终止温度; (2)实验设备要求较低，恒温水浴锅即可满足; (3)普通PCR方法检测至少需要2～3 h，LAMP检测只需要1 h可得到检测结果，能在更短的时间内完成对FPV的检测; (4)借助荧光染料，可目测扩增结果。但需要注意的是，LAMP反应是非常灵敏的反应，即使混入极其微量的扩增产物DNA也有可能导致错误的测定结果， 为避免这样的污染， 试剂配制和加样需在超净工作台内进行， 必要时， 试剂配制和反应结束后产物的电泳分析在两个单独的房间进行操作。

目前， 已有多种针对猫细小病毒的疫苗可以用于该病的防控， 但针对该病的抗原抗体检测， 一直没有商品化试剂盒， 严重制约实验猫的质量提高。由于对该病已普遍采取疫苗免疫，且没有开发出能区分疫苗株和野毒株抗体的血清学方法，因此血清学诊断的意义有限。虽然已有多篇关于FPV病毒核酸的PCR检测方法报道[14-16]，但LAMP方法还未见报道。该方法与PCR方法均以可能含有病毒核酸的病料样品为检测对象， 如粪便、血清、肠黏膜、心脏、肺脏等组织， 具有广泛的适用性， 且该方法更加灵敏、简便。因此， 本研究建立的LAMP方法可为FPV的核酸诊断提供一种灵敏、简便、快速的检测方法， 非常适用于FPV的现场快速检测。