鹿茸干预去卵巢骨质疏松症模型大鼠的实验评价

曲雷鸣， 龚 伟

(辽宁中医药大学附属医院， 沈阳110032)

绝经后骨质疏松症(p o s t-me n o p a u s a l osteoporosis， PMOP) 是指绝经后妇女由于卵巢功能减退， 雌激素水平下降，从而导致骨吸收大于骨形成，出现以低骨量和骨组织显微结构退行性变为其特征，骨脆性和骨折易感性增加的一种全身代谢疾病。中医学并无“骨质疏松症”这一明确病名的记载，现代学者根据骨质疏松症所表现的腰背酸痛、身长缩短、驼背及易于发生骨折等症状， 将其归属于中医学“骨痿”、“骨痹”范畴。研究表明，骨质疏松症病理机制之一在于转化生长因子β1(TGF-β1)与TGF-β1诱导早期反应基因1(TIEG1)mRNA及蛋白表达异常，并可能存在下丘脑-肾-骨的反馈调节机制[1]，鹿茸具有壮肾阳、益精血、强筋骨的功效[2]，常用于骨质疏松症的治疗，本论文以去卵巢骨质疏松症大鼠为研究对象，探讨鹿茸对 TGF-β1以及TIEG1相关性的实验研究。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠50只，未交配，体质量220～250 g，购于辽宁长生生物技术有限公司[SCXK(辽)2015-0001]。饲养室温度 18～22 ℃，相对湿度40%～70%，明暗循环12 h∶12 h[SYXK(辽)2013-0009]。

1.2 实验药品与试剂

鹿茸药材由辽宁中医药大学药学院李峰教授提供， 产地吉林; 中药阳性对照药仙灵骨葆片(淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄)购自国药集团同济堂(贵州)制药有限公司(批号： 160709); 西药阳性对照药补佳乐(戊酸雌二醇)购自法国Delpharm Lille S.A.S 公司(批号： 287A)。

1.3 主要仪器与试剂

XR-36型双能骨密度仪购自美国Northland公司; Infinite M2000多功能酶标仪购自奥地利Tecan公司; MR1822低温高速离心机购自法国Jouan SA公司; DIAX90 型匀浆机购自德国Heidolph公司; BL1500电子天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司; 大鼠TIEG1试剂盒(批号201706)、大鼠TGF-β1试剂盒(批号201706)均购于上海联硕生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立 大鼠适应环境7 d后，按体质量随机分为5组，每组10只，正常组(正常组+蒸馏水)，模型组(去卵巢+蒸馏水)，仙灵骨葆(去卵巢+仙灵骨葆)，补佳乐组(去卵巢+补佳乐)，鹿茸组(去卵巢+鹿茸)。大鼠肌肉内注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg体质量)， 麻醉。模型组和实验组大鼠经腰脊部两侧行纵向切口， 行去卵巢手术， 术后肌肉注射青霉素1.6 mL/kg体质量(80万单位∶4 mL生理盐水)，连续注射3 d。正常组不进行手术。

1.4.2 给药方法 给药前， 鹿茸药材粉碎，过80目筛，加50 ℃温水，制成0.1 g/mL的混悬液，备用；鼠经造模术后7 d开始给药，每日上午灌胃给药 1次，连续给药12周。各组鹿茸给药剂量为每日0.4 g/kg; 补佳乐组给药剂量为每日0.2 mg/kg;仙灵骨葆组给药剂量为每日0.3 g/kg; 正常组与模型组灌胃等体积蒸馏水。实验期间，各组大鼠每周称重一次，并根据体质量变化调整给药剂量。

1.4.3 指标检测 ① 股骨： 取大鼠右后肢股骨带股骨头，迅速剔除所附着的肌肉和筋膜，软组织剔除干净但尽量不破坏骨膜，质量分数0.9%氯化钠溶液冲洗，湿纱布包裹，外包锡纸，-70℃保存应用XR-36型双能骨密度仪进行骨密度(BMD)检测。②下丘脑、肾、股骨： 分别取大鼠下丘脑、肾、左后肢股骨，组织分别与一定比例生理盐水共同置组织研磨器中， 在冰水浴中进行研磨，制成10%的组织匀浆液，静止后离心， 取上清液， -70 ℃保存。采用酶联免疫(ELISA)法对下丘脑、肾、骨组织中TIEG1蛋白活性进行检测。

1.5 统计学处理

实验数据采用 SPSS 17.0 统计软件进行处理，单因素方差分析，实验结果以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMD测定

大鼠去势13周后，与正常组比较，模型组大鼠骨密度显著降低(P＜0.05); 与模型组相比，鹿茸组、仙灵骨葆组均能显著增加大鼠骨密度(表1)。

2.2 TIEG1、TGF-β1 含量

大鼠去势13周后，与正常组比较，模型组大鼠骨、肾、下丘脑中TIEG1、TGF-β1指标水平显著降低(P＜0.05); 与模型组相比，鹿茸组、仙灵骨葆组、补佳乐组TIEG1、TGF-β1指标水平均能显著增加(表2)。

表1 大鼠离体股骨骨密度测定

表2 骨、肾、下丘脑组织中TIEG1、TGF-β1蛋白活性检测 ng/L

3 讨论

传统中医学理论解释说明了“肾”与“骨”的密切关系， 即肾主骨，骨的强弱与肾中精气盛衰关系密切， 故众多实验多从“肾”和“骨”的角度入手， 既阐明了“肾主骨，生髓”的内在机制，又为补肾生髓法治疗骨质疏松症提供了理论基础。沈自尹[3]的研究表明，骨质疏松症的病理机制还与下丘脑-垂体-性腺轴有密切关。郑洪新等[1]研究结果提示，骨质疏松症病理机制之一在于TGF-β1与TIEG1 mRNA及蛋白表达异常， 并可能存在下丘脑-肾-骨的反馈调节机制， 揭示骨的生长发育与肾精-脑髓-骨髓密切相关的部分生物学依据。

TGF-β是多肽类生长因子的一种，属于抑炎细胞因子， 功能多重复杂，目前认为其是骨吸收与骨形成的耦联因子，可以促进成骨细胞分化增殖，在骨重建中起重要作用， 维持骨稳态[4]。TIEG作为TGF-β诱导的早期转录基因，引起细胞形态发生改变，抑制细胞增殖并诱导凋亡，在成骨细胞中TIEG1 的表达对于成骨细胞介导的矿化以及成骨细胞支撑的破骨细胞分化至关重要[5]。研究表明，骨细胞可调节骨质疏松模型家兔TGF-β1、TIEG1的蛋白表达[6]。但目前关于TGF-β1、TIEG1与骨质疏松症的相关性研究较少。

本研究选择取材下丘脑、肾、骨， 研究鹿茸对TGF-β1与TIEG1相关性以及各组织间的异同。结果表明， 模型组骨、肾组织、下丘脑组织TGF-β1、TIEG1 mRNA及蛋白表达明显降低，应用鹿茸干预12周后， 可明显上调骨、肾组织、下丘脑组织TGF-β1、TIEG1 mRNA及蛋白表达水平，对下丘脑-肾-骨具有明显的调控作用，从而阐明中医学“肾藏精生髓主骨”藏象理论对临床实践的指导意义。