骨关节炎患者血清中软骨代谢标记物与骨关节炎的关系研究

徐传慧，潘 昕，李超峰，张大光*

(1.吉林大学第一医院，吉林 长春130021；2.吉林大学第二医院)

骨关节炎(OA)是一种以关节软骨变性及破坏为主要特征的常见病和多发病，超过50%的65岁以上老年人受OA病痛折磨[1]。最近的研究显示在OA的病理过程中ATAMTS-5、Syndecan-4，MMP-13，Aggrecan及collagen II和软骨代谢密切相关。因此，我们利用ELISA技术检测正常人和骨关节炎患者血清中的上述软骨代谢标记物的含量和骨关节炎的关系，找出早期诊断骨关节炎的诊断依据。

1 资料与方法

1.1临床资料

本研究共纳入100名实验对象，按照K-L分级每组20人，平均年龄(45±15岁)。纳入标准为年龄在30-60岁；心功能、肝功能、肾功能正常；排除类风湿性关节炎、感染性关节炎、其他部位骨关节炎，其他疾病的关节炎患者。所有OA患者诊断符合ACR关于OA的诊断标准，所有参加实验者均经患者知情同意并签署知情同意书。

1.2OA患者程度评估

1.2.1所有患者拍摄标准双膝关节站立位X线片，按照Kellgren和Lawrence的放射学诊断标准进行分组，在症例报道书中记录。分级标准见表1。

表1 Kellgren和Lawrence的放射学诊断分级标准

1.2.2次要评价项目 (1)患者的VAS；(2)患者的年龄；(3)患者的体重指数(BMI)。

1.3资料收集

1.3.1一般血液检查 空腹静脉血10 ml，测定以下项目，在症例报告中记录。(1)测定时期：样本采集后立即;(2)测定项目：血常规、ESR、CRP;(3)测定方法：检验科常规测定方法

1.3.2特殊血液检查 空腹静脉血10 ml，所有标本用EDTA抗凝试管，采取后置于4°冰箱不超过7天。为了测定准确，排除技术原因的误差，我们指定专人进行测试，每例标本测定3次。(1)测定时期：样本采集后7天之内及术后半年;(2)测定项目:Syndecan-4，MMP-13,ADAMTS-5,Aggrecan,CollagenⅡ、C4S、C6S;(3)主要试剂和仪器：Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、C4S、C6S，ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，Aggrecan、CollagenⅡELISA试剂盒购自武汉友联特生物技术有限公司。美国Bio-Tek公司ELX800型全自动酶标仪。

1.4ELISA法检测

采用ELISA法检测Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、C4S、C6S、Aggrecan,CollagenⅡ的表达水平，按照说明书操作，在酶标仪450 nm处测得吸光度(A)值。根据各自标准品的浓度及A值绘制标准曲线并得出相应的计算公式，最后代入各个样品的A值计算各个样品的表达水平。

1.5统计学分析

所有的结果都采用SPSS19.0对数据进行统计学分析处理，患者血清中Syndecan-4、MMP-13、 ADAMTS-5、C4S、C6S、Aggrecan,CollagenⅡ的表达水平均以mean±SD表示，多组间比较采用单因素方差分析，两因素间相关性分析采用Spearman相关分析，相关性分为弱(r=0.20-0.39)，中度(r：0.40-0.59)，强(r=0.60-0.79)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清生物标记物在不同组间中的含量测定100名患者按照X线Kellgren和Lawrence的放射学诊断标准进行分组，其中从正常开始为0级组20人，分别分为Ⅰ级组20人、Ⅱ级组20人、Ⅲ级组20人、Ⅳ级组20人。

2.2骨关节炎患者血清中软骨代谢标记物与骨关节炎的关系见表2，Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ与关节炎程度呈正相关，其中Syndecan-4的相关性最高(r值0.714,P值<0.001),其次为MMP-13(r值0.683，P值<0.001)；CollagenⅡ(r值0.632,P值<0.001)。ADAMTS-5(r值0.511,P值<0.003)的相关性均为中度。C4S(r值-0.546,P值<0.001)、C6S(r值-0.556,P值<0.001)、Aggrecan(r值-0.502,P值<0.003)为负相关。

表2 软骨代谢标记物与骨关节炎程度的关系

3 讨论

OA是目前中老年人关节疼痛及致残的主要病因，目前的诊断方法无法满足早期诊断。随着分子生物学的发展，众多研究者在OA患者血液中检测到软骨组织代谢的一些生物分子，发现这些生物分子与OA的发病密切相关，在X线等影像学出现软骨明显退变征象之前，血液中的这些生物分子的浓度即可出现明显改变，因此被用于OA的诊断、预后及疗效监测，所以被称之为OA生物标记物[2]。

最新的研究表明[3,4]，在OA的病理过程中ADAMTS-5，MMP-13在软骨破坏过程中起到核心作用，他们的分泌增加破坏细胞外基质中的Aggrecan及collagen II，最终导致软骨变性及破坏。在这个过程中最新的研究证明Syndecan-4在调控ADAMTS-5的活性过程中起到关键作用,并且和MMP-13的调控有关。

在OA的发病机制中MMP-13起到非常关键的作用，这在MMP-13基因缺陷鼠模型得到证实。在正常的关节软骨中II型胶原蛋白(collagen II)被细胞外基质中的蛋白聚糖(proteoglycan)封闭不能与软骨细胞表面的酪氨酸激酶受体(DDR-2)相互作用，但在OA的关节软骨中，细胞外基质中的蛋白聚糖减少，使II型胶原蛋白裸露，使DDR-2的表达增强，在DDR-2与II型胶原蛋白相互作用下进一步加强MMP-13的活性。在这个过程中使蛋白聚糖(proteoglycan)减少的关键因素是ADAMTS-5,它的表达与活性受多配体蛋白聚糖-4(syndecan-4)的调控，这在Syndecan-4缺陷鼠模型中关节软骨的ADAMTS-5的活性降低，不易发生OA得到证明。这个过程是在激活素受体样激酶ALK-1参与下启动TGF-β信号传导路完成的[5]。

MMP-13(matrix metalloproteinase 13)，又叫胶原酶3，绝大多数的研究证明MMP-13在OA关节软骨破坏过程中起到核心作用。Little等2009年利用MMP-13缺乏鼠模型证明MMP-13缺乏鼠关节软骨破坏减少[6]。这个实验利用MMP-13缺陷鼠做成DMM(destabilization medial meniscal)OA动物模型，观察4周和8周时的病理结果。结果在4周时wild type and MMP-13-/- mice的关节软骨破坏没有明显区别，但在8周时MMP-13-/- mice关节软骨的破坏明显轻于wild type mice；Aggrecan在4周就有明显的减少，在8周的时候更进一步减少，证明了MMP-13减少在Aggrecan缺乏状态下能够抑制关节软骨的破坏。Glasson等2005年在Nature上发表文章发现在OA病理过程中关节软骨中的Aggrecan受到破坏主要是由ADAMTS-5造成的[5]。他们利用ADAMTS-5缺乏鼠制作OA动物模型，发现Aggrecan受到破坏之后使collagen type II裸露，使MMP-13与collagen type II互相作用发挥作用。这个过程syndecan-4结合MMP-3发挥调控ADAMTS-5的作用。

配体蛋白聚糖-4(Syndecan-4)是跨细胞膜表面的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)，它通过硫酸肝素侧链结合细胞外基质中的各种生长因子和细胞因子发挥作用。在软骨细胞中它有4种表达类型，目前研究比较清楚的是Syndecan-4。随着对Syndecan-4认识的逐渐深入，发现它主要在软骨细胞进化和分化的过程中起到重要的调控作用，在病理过程中也具有非常重要的功能[6，7]。在软骨组织中，它特异性的作用在肥大软骨细胞，在OA软骨中表达增强，尤其是Syndecan-4在调控ADAMTS-5活性过程中起到核心作用[4]。在鼠DMM OA模型研究显示，减少Syndecan-4的表达可以显著的减少OA发生，也同时被Syndecan-4基因缺陷鼠的实验模型所证明。在这个发现过程中，发现Syndecan-4调控ADAMTS-5的活性依赖MMP-3。2008年Kon等的研究发现Syndecan-4保护OPN (osteopontin)调控的急性肝脏损伤[8]，2009年Matsui利用OPN基因缺陷鼠OA模型研究中发现Syndecan-4和MMP-13活性有关[9]。这个研究发现在退行性OA和创伤性OA的关节软骨中均缺乏OPN，OPN在OA病理过程中是保护性因素，在OA的病理过程中Syndecan-4抑制OPN的表达，调控MMP-13活性增强，MMP-13主要分解关节软骨中的type II collagen。因此得出结论，OPN在OA病理过程中起到非常关键的作用，并且和MMP-13一起相互作用使蛋白聚糖减少。2011年Shi等报道在平滑肌细胞中Syndecan通过FAK-ERK系统调控MMP-13的表达[10]。

在本次研究的血清中软骨代谢标记物结果中，Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、C4S、C6S、Aggrecan与骨关节炎患者骨关节炎病变程度存在着不同程度的相关性。其中Syndecan-4、MMP-13、CollagenⅡ，可作为骨关节炎早期诊断的辅助检查项目，CollagenⅡ、C4S、C6S可反映出骨关节炎的严重程度。