虫草素对MPTP诱导的帕金森病小鼠运动与认知能力的影响*

刘 丽， 罗广轩， 林健琳， 关燕清， 刘文晓， 肖 鹏， 李楚华

(华南师范大学生命科学学院， 广东 广州 510631)

帕金森病(Parkinson disease, PD)是一种常见的神经系统退行性变性疾病，为世界第二大神经性疾病[1-2]。目前，全球大约有0.3%的人口患有PD，在我国，65岁以上人群中PD发病率高达2%，占全球患者总数40%以上[3-4]。PD主要的病理特征是黑质(substantia nigra, SN)内多巴胺(dopamine, DA)能神经元变性和凋亡，导致DA释放不足，最终造成PD的多种功能障碍[2, 4-6]。目前，PD的发病机制并不明确，主流的学说认为PD是由神经炎症、氧化应激、兴奋性毒性损害和线粒体功能障碍等导致的，也可能是多种因素的综合作用[7-9]。众所周知，PD主要的临床表现为动作迟缓、姿势不稳及震颤等运动性功能障碍[2,10]，随着病情的不断发展，PD一些非运动功能障碍，如睡眠障碍、焦虑、抑郁以及认知障碍等也日益凸显[2,11-12]。

虫草素(cordycepin)又称3’-脱氧腺苷，为冬虫夏草及人工蛹虫草的活性成分，具有抗炎症、抗氧化和抗肿瘤等功效[13-14]。在PD的细胞模型中，虫草素通过增强细胞的抗氧化能力，从而起到保护细胞的作用[15]。另外，在对于PD的新药研究中发现，拮抗腺苷A2A受体(adenosine A2Areceptor, A2AR)可以缓解PD的症状，A2AR的选择性拮抗剂结合左旋多巴的治疗方案已进入临床试验的第3阶段[16]。在动物模型中，A2AR拮抗剂不仅减轻模型动物运动障碍，还可以逆转认知功能障碍[17-19]。作为一种腺苷类似物，虫草素在体外及体内的研究均表现具有调节A2AR表达的作用[19-20]。因而本文希望通过探究虫草素对PD小鼠运动、情绪和认知等行为的影响为PD的治疗提供一种新的思路。

材 料 和 方 法

1 动物

8周龄SPF级健康雄性C57BL/6小鼠，购于中山医科大学动物实验中心，合格证编号：SCXK(粤)2016-0029。饲养温度(24±2) ℃，自然光照，给予充足的饮水和食物，进行1周的适应性饲养。

2 主要试剂

虫草素由华南师范大学生命科学学院植物化学研究室提供，纯度≥98%[21]；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)购自Sigma;抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗体购自Abcam；其它化学试剂均购自碧云天生物公司。

3 主要方法

3.1帕金森小鼠模型的建立及分组处理 将小鼠随机分为正常对照(control)组、模型(MPTP)组及虫草素(cordycepin)组，每组20只。Cordycepin组提前7 d给予口服虫草素溶液(20 mg/kg，共15 d)；control组和MPTP组每天以同体积的生理盐水灌胃。自灌胃的第8天起，MPTP组和cordycepin组开始腹腔注射MPTP溶液(30 mg/kg，连续8 d)，建立PD小鼠模型，control组每天腹腔注射同体积的生理盐水。

3.2HE染色 将动物麻醉之后，快速打开胸腔并剪开心包，自心尖部插入针头，使其进入升主动脉，剪开右心耳，生理盐水进行灌流20 min，待肝脏变白后，缓慢灌注4%多聚甲醛固定30 min。固定完毕后，开颅取脑浸泡于新配制的4%多聚甲醛中固定24 h。常规脱水、透明、进蜡，石蜡包埋制作脑组织蜡块标本。石蜡切片，每张蜡膜的厚度为5 μm, 进行HE染色，光镜下观察黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)细胞神态和数目变化[22]。

3.3Western blot 小鼠迅速断头取出脑组织，利用脑模具分离出SN组织，加入强RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂进行裂解，4 ℃、12 000 rpm离心10 min后，提取总蛋白，并采用BCA法进行蛋白定量。用12% SDS-PAGE分离蛋白并转印至硝酸纤维素膜后，5%的牛奶封闭液室温封闭90 min，加入抗TH抗体(1∶2 500，Abcam)和抗α-tubulin抗体(1∶1 000，碧云天)4 ℃孵育过夜。次日，反复洗膜3次后，辣根过氧化物酶偶联的Ⅱ抗(1∶1 000)室温孵育1.5 h，化学发光法显影，扫描。用图像处理系统对条带灰度进行分析，以α-tubulin作为内参照。

3.4旷场实验(open-field test, OFT) 旷场实验测试前，小鼠放置在原鼠笼中，在旷场实验箱所在的室内适应环境30 min。正式记录前，用75%乙醇清洁测试区域，待气味散去，每只小鼠放置在独立旷场测试区(40 cm×40 cm×37 cm)进行测试，录像15 min，记录小鼠运动轨迹，并利用分析软件分析中间区域活动时间和时间路程、速度以及总路程等实验数据。

3.5自发交替行为(spontaneous alternation beha-vior, SAB) 自发交替行为测试全程保持黑暗，利用Y-maze装置进行自发交替评估探索和空间记忆能力。小鼠在原鼠笼进行30 min的暗适应后进行实验。明确标记Y-maze外侧三臂为“Ⅰ”“Ⅱ”和“Ⅲ”后，将小鼠放进Y-maze的任一壁中，闭合各臂上方挡板，开始观察并记录小鼠在Y-maze中的活动情况。每只鼠测试1次，每次进行10 min，记录小鼠进入不同壁的顺序，统计小鼠总进臂次数及正确率。

3.6水迷宫实验(water maze test, WMT) 水迷宫测试是用于测试实验动物对空间位置感和空间定位的学习记忆能力。定位航行试验历时5 d，每天将小鼠面向池壁分别从4个不同的入水点放入水中各1次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，记为潜伏期。在每日的测试中，每次的入水位置都是随机的，若小鼠在60 s内未找到平台，实验者需引导其至平台并停留15 s，并记其潜伏期为60 s。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0对实验数据进行统计分析，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 虫草素增加PD小鼠黑质致密部细胞数目

HE染色结果示,control组小鼠的SNpc细胞形态正常，细胞数目明显多于MPTP组(P<0.05);而MPTP组小鼠SNpc内细胞胞体小，核变大，轮廓模糊;虫草素可以明显增多细胞数目(P<0.05)，说明虫草素可以阻止由MPTP所造成的SNpc细胞数目减少，见图1。

Figure 1.Cordycepin increased the number of cells in the SNpc in PD mice (HE staining, ×200). Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

图1虫草素增加PD小鼠黑质致密部细胞数目

2 虫草素提高PD小鼠黑质内TH的表达量

MPTP导致小鼠SN内TH的表达量明显减少(P<0.05)，而虫草素可以明显逆转TH表达量减少的趋势(P<0.05)，见图2，说明虫草素对SN内的多巴胺能神经元有保护作用，减少MPTP的毒害。

3 虫草素减轻PD小鼠的运动迟缓

与control组相比，MPTP组小鼠的平均速度明显降低(P<0.05)，中央区域路程减少，但并没有显著差异，说明MPTP导致小鼠出现运动迟缓，但并不引起焦虑行为；而虫草素显著提高小鼠的运动速度(P<0.05)，但并不影响小鼠在中央区域路程，说明虫草素可以改善短期PD小鼠的运动异常，见图3。

Figure 2.Cordycepin increased the expression of TH in SN in PD mice. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

图2虫草素提高PD小鼠黑质内TH蛋白表达量

4 虫草素提高PD小鼠探索和空间记忆能力

与control组相比，MPTP导致小鼠总进臂次数和正确率都明显减少(P<0.05)，说明MPTP导致小鼠的探索能力和空间记忆能力出现障碍;虫草素能够增加小鼠的总进臂次数并提高正确率(P<0.05)，说明虫草素改善PD小鼠的探索和空间记忆能力障碍，见图4。

5 虫草素不影响PD小鼠学习记忆行为

与control组相比，MPTP组小鼠的潜伏期有延长，但没有显著差异;虫草素可以缩短由MPTP引起的潜伏期延长，但也没有显著差异;说明本研究所模拟的PD小鼠模型更适用于研究PD早期的症状，并没有出现学习记忆能力的障碍，见图5。

讨 论

PD最明显的特征是SN内多巴胺能神经元的坏死，TH是儿茶酚胺合成过程中的限速酶，SN中TH阳性神经元大多是多巴胺能的，因此TH可以看作是SN中多巴胺能神经元的标志物，SN内TH表达含量成为检测PD模型的一大指标[23]。Deguil等[24]使用30 mg/kg MPTP连续腹腔注射5 d，发现小鼠SN内的TH阳性神经元急剧减少。在本研究中，采用30 mg/kg的MPTP 连续注射8 d，HE染色结果显示，MPTP导致小鼠SNpc内细胞数目明显减少，Western blot结果也显示SN内TH表达量明显降低，表明MPTP导致小鼠出现PD样的病理特征。

Figure 3.Cordycepin attenuated bradykinesia in PD mice. Mean±SEM.n=20.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

图3虫草素减轻PD小鼠的运动迟缓

Figure 4.Cordycepin improved the explorative ability in PD mice. Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

图4虫草素改善PD小鼠的探索及空间记忆能力

在PD的细胞模型中，虫草素通过提高细胞内氧化酶的活性有效抑制由6-OH多巴胺引起的细胞凋亡，发挥保护细胞的作用[15]。陈琴等[25]也发现，虫草素可以显著抑制鱼藤酮诱导的的细胞凋亡。另外，虫草素对鱼藤酮引起的PD大鼠多巴胺能神经元凋亡具有抑制作用[26]。在本实验中，虫草素同样逆转了MPTP引起的SNpc内的细胞数目减少和SN内TH表达量降低的现象，表明虫草素可以减少MPTP对SN内多巴胺能神经元的损伤，在PD小鼠中发挥神经保护作用。

PD患者最明显的临床表现为出现严重的运动功能障碍，并随着病情的加剧，萎靡不振、焦虑以及认知障碍等非运动功能障碍越加明显[11-12]。虫草素对PD小鼠具有神经保护作用，那能否在行为上表现出来？OFT是用于评价小鼠自发行为以及焦虑状态的经典行为学实验[27]。本实验结果显示虫草素改善由MPTP引起的平均速度减慢，总路程减少，但小鼠并没有出现焦虑现象，表明虫草素可以改善PD小鼠的运动迟缓症状。SAB实验检测小鼠对新异环境的探索能力以及空间记忆能力[28]，虫草素增加小鼠的总进臂次数，并提高其正确率，表明虫草素可以增强PD小鼠的探索和空间记忆能力。WMT检测实验动物对空间位置感和方向感的学习记忆能力[29-30]。本实验结果显示，MPTP虽使小鼠的潜伏期增加，但是并没有显著差异，虫草素虽有一定的改善作用，但也并不明显。此结果表明，本实验所模拟的PD小鼠模型可能更多地接近PD患者的早期症状，表现出运动和探索能力下降，但并没有出现焦虑和学习记忆能力的缺陷，说明此模型并不适用于研究PD患者后期的各种非运动障碍，例如焦虑和记忆障碍等。

Figure 5.Cordycepin had no effect on the ability of learning and memory in PD mice. Mean±SEM.n=12.

图5虫草素不影响PD小鼠的学习记忆能力

综上所述，我们发现MPTP处理导致小鼠SN内多巴胺能神经元丢失，并表现出PD早期的运动障碍和探索能力下降，而虫草素处理后，可以明显减轻这种症状，说明虫草素对PD小鼠具有神经保护作用，并能在运动和探索能力上显现出来。