DMOG对间充质干细胞生物学特性影响的研究

姜丽霞葛婷婷周丽萍刘丽珍竺璐婕周斌杰余勤

1.浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053 2.浙江大学附属第一医院骨髓移植中心

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源广泛、具有强大增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞，已成为再生医学领域的研究热点之一。目前临床上MSCs主要用于体外细胞移植治疗[1-2]。尽管该法可行，但步骤繁琐、扩增到所需细胞量需要的周期较长、细胞来源受限、容易发生污染及存在潜在的致瘤风险等缺点仍然限制了MSCs的广泛应用。近年来有报道指出，特定细胞因子和药物的刺激可促进细胞信号通路的一系列信号传导，使干/祖细胞在短时间内从骨髓进入外周循环池，进一步迁移、归巢到达损伤部位，参与组织修复[3-4]。因此，有效的MSCs体内动员可以避免上述体外移植的诸多缺点，具有无可比拟的高效性和低创性，为临床各类疾病的治疗带来了新希望[5-9]。

目前，国内外尚无公认有效的MSCs动员剂。本课题组前期研究发现，二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxaloylglycine，DMOG） 可 以 在 体 内 动 员MSCs[10]。因此本研究通过体外实验，探讨了不同浓度DMOG对MSCs的增殖能力、细胞周期、迁移能力、多向分化能力等生物学特性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠，体质量80～100g，由浙江中医药大学动物实验中心提供[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]，来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司 [实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]。

1.1.2 主要试剂 DMOG购于Cayman公司（批号：71210）；DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液均购于 Invitrogen公司（批号：1785916、10378016）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA均 购 于 Gibco 公 司 （批 号 ：614318、2015041203）；MSCs成骨诱导分化培养基、油红O储存液均为广州赛业生物科技有限公司产品（批号：RASMX-90021、T150610G001）；硝酸银、硫代硫酸钠均购于Sigma公司（批号：S8157、72049）；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBRPremix ExTagTMⅡ（TliRnase H Plus）试剂盒均购于Takara公司（批号：RR420Q、RR054A）。

1.1.3 主要仪器设备 TE2000-S型倒置相差显微镜为Nikon公司产品；PN PAL-CAXXXLSM2型纯水仪购于美国PALL公司；3111型二氧化碳培养箱购于美国FORMA公司；3K-15型台式高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品，SpectraMax 190型酶标仪为美国MD公司产品，TS-1型脱色摇床购于海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs的体外分离及培养 参照本课题组前期已建立的方法[11]，采用全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓MSCs，通过多次传代纯化细胞。

1.2.2 细胞分组 MSCs传代至P4代时，根据本课题组前期研究结果，将 MSCs分为 4组：DMOG 0μmol·L-1组（空白对照组）、DMOG 20μmol·L-1组、DMOG 40μmol·L-1组和 DMOG 80μmol·L-1组。DMOG以DMEM/F12培养基稀释，使各组中DMOG终浓度分别为 0、20、40、80μmol·L-1，用于后续生物学特性研究。

1.2.3 CCK-8法检测DMOG对MSCs增殖能力的影响 将P4代MSCs以1×104个/mL的细胞密度重悬于无FBS的DMEM/F12培养基中，接种于7块96孔板。次日，吸去各孔中细胞培养液，加入含不同浓度DMOG的DMEM/F12培养基，每组6个复孔。随机取1块96孔板，加入CCK-8试剂，孵育后酶标仪450nm测定吸光度值。此后连续6d，每天同一时间段重复上述操作。以未接种细胞的孔作为调零孔，以培养时间为横坐标，各组对应OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 流式细胞术分析DMOG对MSCs细胞周期的影响 各组MSCs经不同浓度DMOG处理24h后，收集细胞，加入预冷的70%乙醇，4℃冰箱固定过夜。次日，收集并洗涤细胞，每管细胞样品加入预制的碘化丙啶染液，37℃避光孵育。流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用FlowJo软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

1.2.5 Transwell法检测DMOG对MSCs迁移能力的影响 将P4代MSCs以1×105个/mL的细胞密度重悬于含不同浓度DMOG的培养基中，收集各组细胞悬液接种于Transwell小室上室，以含FBS的DMEM-LG培养基加入小室下层，培养15h后擦去小室上层未迁移的细胞。将上室的膜浸泡于4%多聚甲醛中固定，0.1%结晶紫染色，每组镜下随机选取9个视野拍照并计数。

1.2.6 诱导分化培养法研究DMOG对MSCs多向分化能力的影响 将P4代MSCs以1×105个/mL的细胞密度接种于含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中，加入6孔板中培养。当细胞融合80%时，吸去孔内完全培养基，6孔板各孔分别更换为新鲜配制的含不同浓度DMOG的成骨、成脂和成软骨分化诱导培养基，培养至21d，再分别以硝酸银染色法、油红O染色法和甲苯胺蓝染色法鉴定结果。

成神经分化结果采用免疫荧光检测。先用含不同浓度DMOG的成神经分化预诱导培养基培养24h后，更换成神经分化诱导培养基继续培养6h，弃去诱导培养基，经4%多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100浸泡，10%山羊血清封闭液室温封闭，加入小鼠抗大鼠Nestin或GFAP一抗4℃孵育过夜，二抗避光室温孵育，DAPI复染后，倒置相差荧光显微镜下观察荧光情况，选取任意9个视野拍照并进行阳性细胞计数，分析结果。

1.2.7 Real-time qPCR检测MSCs分化特异性基因的表达 诱导分化24、72、168h时分别收集各组细胞，依据Trizol操作说明，提取各组总RNA。按照Prime－ScriptTMRT Master Mix和SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（TliRnaseH Plus）试剂盒的操作步骤，逆转录合成cDNA，然后进行目的基因的扩增，使用StepOne Software v2.2.2软件分析实验数据，采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMOG对MSCs增殖能力的影响 未经DMOG处理的MSCs，外形为长梭形，呈漩涡状生长；经不同浓度DMOG处理后的细胞，其形态均无明显改变。见图1。DMOG处理后，各浓度组细胞生长曲线均接近S型。接种后第1～3天为潜伏期，各组细胞增殖均较慢，从第3天开始各组细胞开始快速增殖，进入对数生长期，第6天后各组细胞增殖速度普遍减慢。潜伏期时，与 DMOG 0μmol·L-1比较，DMOG 20、40、80μmol·L-1组细胞增殖能力稍弱，差异有统计学意义（P＜0.05）；DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。进入对数生长期后，细胞增殖能力提高。第 6 天时，DMOG 20、40、80μmol·L-1组细胞增殖能力均显著高于DMOG 0μmol·L-1组，差异有统计学意义（P＜0.01），其中 DMOG 40μmol·L-1组细胞增殖能力最强（P＜0.01）。见图2。

图1 MSCs的形态学观察（200×）Fig.1 Morphological observation of MSCs(200×)

2.2 DMOG对MSCs细胞周期的影响 流式细胞术检测结果显示，处理 24h后，与 DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20μmol·L-1组中 G0/G1期的细胞比例减少，而S期+G2/M期细胞比例增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；DMOG 40、80μmol·L-1组 MSCs中 G0/G1期细胞比例均显著减少（P＜0.01），而S期+G2/M期细胞比例均显著增加（P＜0.01）。同时，DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，G0/G1期和 S 期+G2/M 期细胞比例均无统计学差异（P＞0.05）。见图3。

2.3 DMOG对MSCs迁移能力的影响 诱导培养15h后经结晶紫染色，显微镜视野中紫色多角形或长梭形的细胞即为迁移穿过Transwell小室上室膜的MSCs。与 DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20、40、80μmol·L-1组中MSCs细胞迁移数均增多，其中DMOG 20、80μmol·L-1组细胞迁移数目增加显著，差异有统计学意义（P＜0.01），且该两组均高于 40μmol·L-1组，差异有统计学意义（P＜0.01），但该两组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图2 DMOG对MSCs增殖能力的影响Fig.2 Effects of DMOG on proliferation of MSCs

图3 DMOG对MSCs细胞周期的影响Fig.3 Effects of DMOG on cell cycle of MSCs

图4 DMOG对MSCs迁移能力的影响Fig.4 Effects of DMOG on migration of MSCs

2.4 DMOG对MSCs多向分化能力的影响 硝酸银染色结果显示，各组细胞染色均呈阳性，有黑色钙盐着色，其中，DMOG 0μmol·L-1组黑色钙盐分泌集中且聚集在个别区域，DMOG 20μmol·L-1组 MSCs钙盐分泌较多且在孔板中分布均匀，DMOG 40、80μmol·L-1两组黑色钙盐分泌较为稀疏散在。见图5-1。甲苯胺蓝染色结果显示，各组细胞均呈阳性着色，其中，DMOG 20μmol·L-1组细胞呈明显异染性着色，即细胞外基质被染成紫色，细胞核呈深蓝色，表明诱导后细胞产生了软骨细胞基质糖胺聚糖。见图5-2。油红O染色结果显示，各组细胞中脂滴呈橘红色。见图5-3。免疫荧光结果显示，各组MSCs经诱导分化后，细胞表面Nestin阳性表达，GFAP阴性表达。见图5-4、5-5。提示DMOG处理后MSCs依然保留了成骨、成脂、成软骨和成神经分化能力。

2.5 DMOG对MSCs分化特异性基因表达的影响

2.5.1 成骨分化 成骨分化基因Bglap2检测结果显示，诱导分化 1d 时，与 DMOG 0μmol·L-1组比较，其余3组的Bglap2 mRNA相对表达量均无统计学差异（P＞0.05）；DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，随着DMOC浓度增加，Bglap2 mRNA的相对表达量逐渐下降，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

诱导分化3d时，各组Bglap2 mRNA相对表达量均明显升高，与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20μmol·L-1组相对表达量显著升高（P＜0.05）；而其余两组差异无统计学意义（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3组间比较，随着 DMOG 浓度增加，Bglap2 mRNA的相对表达量逐渐下降，其中DMOG 20μmol·L-1组 Bglap2 mRNA 的相对表达量显著高于 80μmol·L-1组（P＜0.01）。

图5 -1 DMOG对MSCs成骨分化能力的影响（硝酸银染色，200×）Fig.5-1 Effects of DMOG on osteogenic differentiation of MSCs(silver nitrate stained，200×)

图5 -2 DMOG对MSCs成软骨分化能力的影响（甲苯胺蓝染色，200×）Fig.5-2 Effects of DMOG on chondrogenic differentiation of MSCs(toluidine blue stained,200×)

图5 -3 DMOG对MSCs成脂分化能力的影响（油红O染色，200×）Fig.5-3 Effects of DMOG on adipogenic differentiation of MSCs(oil red O stained,200×)

图5 -4 DMOG对MSCs成神经分化能力的影响（Nestin蛋白荧光染色，200×）Fig.5-4 Effects of DMOG on neural differentiation of MSCs(Nestin fluorescent stained,200×)

图5 -5 DMOG对MSCs成神经分化能力的影响（GFAP蛋白荧光染色，200×）Fig.5-5 Effects of DMOG on neural differentiation of MSCs(GFAP fluorescence stained,200×)

诱导分化7d时，各组细胞Bglap2 mRNA相对表达量均呈下降趋势。与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 80μmol·L-1组 Bglap2 mRNA 相对表达量显著下降（P＜0.05），而其余两组差异无统计学意义（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，随着DMOG浓度增加，Bglap2 mRNA的相对表达量也逐渐下降，DMOG 20、40μmol·L-1这两组的 Bglap2 mRNA相对表达量均显著高于DMOG 80μmol·L-1组（P＜0.01，P＜0.05），但该两组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明随诱导时间增加，成骨诱导分化特异性基因Bglap2 mRNA相对表达量先升高后下降，诱导分化 3d时达到峰值；DMOG 20μmol·L-1处理对MSCs成骨分化能力具有显著促进作用，但随DMOG浓度增加，Bglap2 mRNA相对表达量逐渐降低。见图6A。

2.5.2 成脂分化 成脂分化基因Pparg2检测结果显示，诱导分化 1d时，与同时点 DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20μmol·L-1组 Pparg2 mRNA 相对表达量显著增高（P＜0.05），其余两组差异无统计学意义（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，DMOG 20、80μmol·L-1两组均显著高于 DMOG 40μmol·L-1组（P＜0.01，P＜0.05），但该两组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

诱导分化3d时，各组Pparg2 mRNA相对表达量均呈现上升趋势。与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，其余3组 Pparg2 mRNA相对表达量均下降（P＜0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，DMOG 20μmol·L-1组 Pparg2 mRNA 的相对表达量明显高于其余两组（P＜0.05）。

诱导分化7d时，与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组 Pparg2 mRNA相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；而该3组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明MSCs中Pparg2 mRNA相对表达量增加具有时间依赖性，而不同浓度（20、40、80μmol·L-1）DMOG作用后，MSCs内Pparg2 mRNA相对表达量增加随时间波动；且随诱导时间增加，DMOG对MSCs的成脂分化逐渐表现出一定的抑制作用。见图6B。

2.5.3 成软骨分化 成软骨分化基因CollagenⅡ检测结果显示，诱导分化1d时，与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20μmol·L-1组 Collagen ⅡmRNA相对表达量显著升高（P＜0.01），其余两组CollagenⅡ mRNA相对表达量无统计学差异（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，DMOG 20μmol·L-1组 Collagen Ⅱ mRNA 相对表达量最高，与另外两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

诱导分化3d后，与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，其余3组mRNA相对表达量均增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3组间比较，DMOG 80μmol·L-1组 Collagen Ⅱ mRNA相对表达量最高，与另外两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

诱导分化7d时，与同时点DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20μmol·L-1组 Collagen Ⅱ mRNA 相对表达量显著增加（P＜0.01），DMOG 40、80μmol·L-1组表达量则无统计学差异（P＞0.05）。DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组间比较，DMOG 20μmol·L-1组CollagenⅡ mRNA相对表达量最高，与另外两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。说明较低浓度（20、40μmol·L-1）DMOG 作用后，MSCs内 CollagenⅡ mRNA表达增加具有时间依赖性。见图6C。

2.5.4 成神经分化 成神经分化基因检测结果显示，诱导分化后各组MSCs均表达神经元样细胞标志性分子 Nestin。与同时点 DMOG 0μmol·L-1组比较，DMOG 20、40、80μmol·L-1这 3 组 Nestin 阳性细胞率均无统计学差异（P＞0.05），提示DMOG处理对MSCs成神经分化能力无明显影响。见图6D。

3 讨论

图6 DMOG对MSCs分化特异性基因表达的影响Fig.6 Effects of DMOG on differentiation specific genes of MSCs

MSCs动员即采用动员措施或动员剂促使骨髓中MSCs释放并迁移到外周血，参与损伤修复、组织再生等[12]。在组织损伤的第一时间，给予一定的动员措施，可使MSCs在短时间内从骨髓跨越细胞及血管进入外周循环池，进一步迁移、归巢进入损伤部位，参与组织修复。正常生理状态下，人体外周循环中的MSCs含量极低[13]。研究发现，当机体在应激、损伤、烧伤等病理状态下，可发生MSCs内源性动员[14]。Rochefort等[15]发现慢性缺氧可使大鼠周围循环中MSCs数量显著增加。本课题组前期研究证实，基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）受体阻断剂AMD3100能提高外周血中的MSCs数量[12]，DMOG也可以动员ICR小鼠和SD大鼠的MSCs进入外周血[10,16]。DMOG作为一种小分子酮戊二酸类似物，通过与内源性2-酮戊二酸竞争，从而抑制脯氨酸羟化酶，可作为高效安全的低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）稳定剂，且对动物及人类均无毒性[17]。Kelly等[18]研究发现，DMOG有利于心脑血管疾病的治疗。本课题组前期研究发现，DMOG对MSCs具有动员作用，其机制是通过稳定HIF-1表达，从而调控其下游血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与 SDF-1α 的表达，从而发挥 MSCs动员作用[10]。

本研究以不同浓度DMOG处理MSCs，浓度20μmol·L-1时促进 MSCs增殖，浓度达到 40μmol·L-1时促进作用最明显。有研究发现，重组Wnt3a、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）联合 AMD3100、氯化锂（lithium chloride，LiCl）等药物均可动员MSCs进入外周血，并促进其增殖和分化[19-21]。在本研究中，DMOG处理可以提高MSCs中S期+G2/M期的细胞比例，且3个浓度组间无统计学差异。研究报道指出，细胞周期的调控主要有外源性调控和内源性调控两种，外源性调控来源于细胞因子及一些外界刺激的作用[22]。笔者推测，DMOG作为一种外源性调控因素，其促进MSCs增殖可能是通过调控细胞周期相关蛋白的表达来实现的。

细胞迁移是细胞归巢的重要机制，也是影响干细胞动员的主要因素之一。本研究发现，DMOG可促进MSCs迁移能力，且 DMOG 20μmol·L-1时促迁移作用更为显著。Marchbank 等[23]研究发现 6.25～25μmol·L-1的DMOG能促进人HT29细胞的迁移能力，并呈剂量依赖性，其中25μmol·L-1促迁移活性最强；随着DMOG浓度增加，对细胞迁移则呈现抑制作用。

本研究研究发现，20～80μmol·L-1范围内，低浓度DMOG可上调成骨细胞特异性基因Bglap基因表达，高浓度则会下调Bglap基因表达。随诱导时间增加，DMOG对Pparg2的下调作用逐渐明显；而随给药浓度增加，Pparg2转录活性逐渐降低。随浓度增加，DMOG促进MSCs成软骨分化的作用在一定程度上减弱。DMOG处理后MSCs仍保留了原有的成神经分化能力，不同浓度的DMOG对MSCs成神经分化能力无显著促进或抑制作用。

有学者认为，MSCs成骨分化和成脂分化的过程不是彼此孤立的，而是存在着相互制约的动态平衡关系，诱导成骨分化过程中DMOG可能通过激活MSCs中Wnt/β-catenin信号通路从而抑制其成脂分化过程，进而下调成脂分化转录因子Pparg2的表达[24-26]。许多调控机制对两者也具有正反向调控作用[27-28]。Taipaleenmaki等[29]认为易于成骨的MSCs亚群Wnt信号基因高表达，而易于发生成脂分化的MSCs亚群则高表达Wnt通路抑制因子分泌型卷曲相关蛋白-1（secreted frizzled-related proteins，sFRP-1）。而Vanella等[30]研究发现，众多调节因子可使MSCs由成骨分化链转化为脂肪分化链，进而抑制其成骨分化。本课题组前期研究证实Wnt/β-catenin信号通路对大鼠MSCs向神经元样细胞分化有重要调节作用[31]。因此，DMOG干预后，MSCs的成骨分化、成脂分化以及成神经分化之间是否通过Wnt/β-catenin信号通路相互影响尚有待于进一步研究。

综上所述，不同浓度DMOG处理后，可显著提高MSCs增殖、迁移能力，但对其多项分化能力产生不同的影响。其中20μmol·L-1DMOG可促进MSCs成骨和成软骨分化能力，抑制其成脂分化能力，对其成神经分化能力无明显影响。