三脚风炉水提物对痛风性关节炎大鼠NLRP3炎性体及炎症因子的影响

陈学智吕惠卿陈建治王一奇温成平

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.景宁县人民医院

痛风是因嘌呤代谢紊乱，血尿酸生成增多和（或）肾脏排泄尿酸减少，导致尿酸钠（monosodium urate，MSU）晶体沉积，从而引起的一种难治愈、易复发的疾病。研究证实，MSU刺激Nod样受体蛋白3（Nodlike receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性体活化可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-l（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1），促使白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）分泌，导致痛风性关节炎急性发作。因此，NLRP3炎性体是痛风发生发展的关键环节[1]。

畲药是畲族人民几千年实践经验总结的传统民族医药，在防治风湿、跌打损伤、黄疸性肝炎、骨髓炎等疾病方面有诸多祖传秘方和经验方，已成为祖国医药宝库的一个重要组成部分[2]。长期居住在中国东南部山区的畲族人民通常采用三脚风炉防治痛风。三脚风炉属于畲药中的习用药材，为伞形科茴芹属植物条异叶回芹（Primpinellae diversifoliae）的干燥全草，又名八月白，具有散瘀止血、活血止痛、除湿解毒等功效，收载于《浙江省中药炮制规范》[3-4]。笔者团队前期研究证实三脚风炉具有较强的抗炎镇痛作用[5-6]。为进一步开发利用畲药资源，本文通过研究三脚风炉水提物（Primpinellae diversifoliae water extracts，PDW）对痛风性关节炎大鼠NLRP3炎性体及炎症因子IL-1β和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，拟探讨三脚风炉治疗痛风性关节炎的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性SPF级SD大鼠24只，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号[SYXK（浙）2013-0184]。根据实验室动物护理和使用指南，动物分组分笼，饲养环境温度（20±2）℃，相对湿度为（50±5）%，标准饲料喂养，自由摄食饮水。

1.2 药物和主要试剂 三脚风炉采自丽水市景宁县，经浙江中医药大学陈孔荣副教授鉴定为伞形科茴芹属植物条异叶回芹（Primpinellae,diversifoliae）的干燥全草，加水浸泡回流提取，合并两次滤液，旋蒸浓缩冻干得PDW，临用前配制成500mg·kg-1的溶液。RNA提取试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix购于 Takara公司（批号：RR036A）；SYBR Premix EX TaqTMⅡ购于 Takara公司（批号：RR820B）；IL-1β 和TNF-α试剂盒购于碧云天生物技术有限公司（批号：160312、171204）；美洛昔康购于华东大药房（批号：170218）；聚山梨酯80购于华东医药股份有限公司（批号：151229）；MSU为实验室自行制备；实验用水为Milli-Q超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 BS423S电子天平购于北京赛多利斯科学仪器有限公司；JY-04A多功能粉碎机购于浩瀚工贸有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品；多功能酶标仪为美国Thermo Scientific公司产品；5417R高速离心机和PCR仪为德国Eppendorf公司产品。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制作及分组

1.4.1.1 MSU混悬液的制备 准确称取尿酸4.0g，置于800mL沸水中，加入0.5mol·L-1氢氧化钠9mL，调整pH至8.9。用玻璃棒搅拌，加热至浑浊溶液变成清亮，室温冷却后过夜，过滤得MSU混悬液，经70℃干燥箱烘干，180℃高温灭菌。临用时称取250mg MSU，加入9mL无菌0.9%氯化钠溶液，再加入1mL聚山梨酯80，加热搅拌，配成10mL MSU混悬液备用。

1.4.1.2 动物分组及给药 将大鼠分为正常对照组、模型组、美洛昔康组和PDW组，每组6只。正常对照组和模型组大鼠以同体积0.9%氯化钠溶液灌胃，美洛昔康组以美洛昔康（3mg·kg-1）灌胃，PDW组以PDW（500mg·kg-1）灌胃，2 次/d，连续 7d。美洛昔康和PDW的剂量选择参考预实验。第7天灌胃给予受试物1h后造模。正常对照组大鼠右后足踝关节腔内注射0.9%氯化钠溶液0.2mL，其余各组注射MSU混悬液0.2mL。

1.4.1.3 急性痛风性关节炎模型制作 参照文献[6]复制急性痛风性关节炎模型。受试大鼠麻醉后选右后足踝关节外侧后方为穿刺点，针口斜面朝前上方与胫骨成45°夹角刺入踝关节腔，以6号注射针向关节腔一次性注入MSU混悬液0.2mL，注射部位出现明显肿胀表示建模成功。

1.4.2 检测指标

1.4.2.1 踝关节肿胀情况测量 各组大鼠在造模前以游标卡尺测量右后足踝关节下0.5mm处的直径，造模后5、24、30、48h，在原部位以相同方法测量，比较致炎前后踝关节肿胀情况。

1.4.2.2 Real-time PCR 检测 NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达 造模48h后将大鼠断颈处死，快速分离大鼠受试侧踝关节及周围软组织，将组织剪碎，在碾钵中加入液氮，进一步将组织研磨成粉末，按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，然后分别根据基因库中 mNLRP3、mASC、mcaspase-1和 mβ-actin 核苷酸序列设计引物，委托生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。将RNA转录成cDNA后，使用SYBR GreenⅠ实时定量PCR对上述mRNA表达量进行检测。反应结束后分析基因扩增的Ct值，以β-actin为内参，计算目的基因相对表达量2-ΔΔCT，计算公式如下：△CT=目的基因CT值-内参基因CT值，ΔΔCT=ΔCT实验组-ΔCT对照组。PCR产物扩增的特异性通过熔解曲线进行分析，以消除引物二聚体等副反应产物的影响。反应条件为预变性94℃1min，变性 95℃ 10s，退火 58℃ 10s，延伸 72℃ 10s，共40个循环，最后72℃延伸5min。每个标本检测3个复孔。

1.4.2.3 大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量的测定造模48h后，大鼠处死前眼眶取血，静置析出血清后，4℃、1 000r/min离心10min。取上清液，严格按照试剂盒说明进行操作，以ELISA法检测IL-1β和TNF-α含量。各孔用酶标仪在450nm测定OD值，用试剂盒标准品制作标准曲线，根据样品吸光值计算IL-1β和INF-α含量。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

1.5 统计学分析 应用Graphpad Prism 5统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠踝关节肿胀情况比较 模型组大鼠右后足踝关节发生肿胀，在造模24h后达峰值。踝关节直径造模前为（7.08±0.29）mm，造模 24h为（11.29±0.34）mm，48h 为（9.42±0.26）mm，提示急性痛风性关节炎模型建模成功。与模型组比较，美洛昔康组给药后5、24、30、48h大鼠踝关节直径均小于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.001）；PDW 组给药后 5、24、30、48h能明显减轻大鼠踝关节肿胀，踝关节直径小于模型组，差异有统计学意义（P＜0.001，P＜0.05）。与美洛昔康组比较，PDW组踝关节肿胀直径差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 1。

图1 各组大鼠踝关节直径比较Fig.1 Comparison of ankle joint diameters of all groups

2.2 各组大鼠踝关节组织NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达比较 与正常对照组比较，模型组NLRP3、ASC、caspase-1的 mRNA 表达显著升高 （P＜0.001）；与模型组比较，美洛昔康组 NLRP3、ASC、caspase-1 的 mRNA 表达量下降（P＜0.001，P＜0.01），PDW组NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达也明显下降（P＜0.001，P＜0.01）。与美洛昔康组比较，PDW 组NLRP3的mRNA表达量高于美洛昔康组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但两组间ASC和caspase-1的mRNA表达差异没有统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠踝关节组织NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达比较Tab.2 Comparison of mRNA expression of NLRP3,ASC and caspase-1 in ankle joint of each group

2.3 各组大鼠血清IL-1β和TNF-α含量比较 与正常对照组比较，模型组大鼠炎症因子IL-1β和TNF-α含量均增高（P＜0.001）。与模型组比较，美洛昔康组IL-1β 和 TNF-α 含量明显减低（P＜0.001）；PDW 组IL-1β和TNF-α含量也明显低于模型组（P＜0.001，P＜0.01）；但均高于美洛昔康组（均 P＜0.05）。见表 3。

表3 各组大鼠血清IL-1β和TNF-α含量比较（pg·mL-1）Tab.3 Comparison of content of IL-1β and TNF-α in serum of each group

3 讨论

随着经济发展和生活方式改变，痛风患病率逐年上升，现已成为沿海一带的常见病[7]。现代医学认为，痛风是因嘌呤代谢紊乱，导致血尿酸生成增多和（或）肾脏排泄尿酸减少，从而引起的一种难治愈、易复发的代谢性疾病。痛风性关节炎多呈间歇性发作，发作时常见大关节红肿热痛，病情缠绵难愈。目前，临床治疗痛风急性发作首选非甾体类抗炎药如美洛昔康、依托考昔等，其次选用秋水仙碱，上述药物控制不佳时选用糖皮质激素。但以上药物具有较为明显的副作用，如非甾体抗炎药容易引起胃肠道溃疡或出血、肾功能不全；秋水仙碱容易引起腹泻等，影响患者的依从性。畲药三脚风炉用于防治痛风有其独特的优势，具有耐药性低、副作用少、药源丰富、价格低廉且作用靶点多等特点，标本兼治、防治并举。

NLRP3炎性体又名嗜中性白细胞碱性磷酸酶3（neutrophilic alkaline phosphatase3，NALP3） 炎性体，是一种大分子蛋白复合体，由NLRP3蛋白、ASC和caspase-l组成，是目前研究最多的炎性体，在炎症反应和天然免疫中起重要作用。最新研究成果认为，痛风急性发作与NLRP3炎性体的活化密切相关，MSU在关节部位的沉积导致NLRP3炎性体的活化，引起炎症因子的释放，如IL-1β、TNF-α、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等，引起炎症反应发生，是急性痛风性关节炎发作的重要原因[8-9]，可见，NLRP3炎性体是调节IL-1β和TNF-α的上游关键蛋白。本研究结果发现，与模型组比较，PDW组给药后5、24、48h能够明显抑制踝关节肿胀，且能明显下调大鼠踝关节致炎部位NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达，降低血清IL-1β和TNF-α含量。与美洛昔康组比较，PDW组踝关节直径无统计学差异，且ASC和caspase-1的mRNA表达差异也无统计学意义，由此推测三脚风炉抗痛风性关节炎可能通过抑制NLRP3炎性体的活化，阻止IL-1β和TNF-α炎症介质的分泌，从而减轻炎症反应，发挥其抗痛风作用，且与美洛昔康作用效果接近。

三脚风炉为畲族习用药材，长期流传于畲族民间，治疗痛风具有较好的临床疗效，能显著减少痛风关节炎发作次数，因其副作用少和耐药性低，在痛风急性发作期缓解关节肿痛方面具有其独特的开发利用价值，本文通过研究三脚风炉对NLRP3炎性体及炎症因子的影响，初步阐明了其抗痛风关节炎作用机制，为畲药治疗痛风提供了实验依据。