虎杖治疗动脉粥样硬化物质基础与作用机制的网络药理学研究

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据《中国心血管报告2017》统计，以冠心病和脑卒中为代表的动脉粥样硬化性心血管病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)占疾病死亡构成的40%以上，为我国居民的首位死因[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是ASCVD最重要的病理学基础，现代医学认为炎症反应贯穿AS发生发展的全过程，AS是动脉壁的慢性炎症性疾病[2]。以陈可冀院士为首的科研团队在充分认识AS现代病理生理机制的基础上，结合传统中医学对“瘀”“毒”的认识，创新性地提出并验证了ASCVD“瘀毒”病机理论[3]，活血解毒成为独具特色的AS中医治法[4]。中药虎杖(Polygonum Cuspidatum，Japanese Fleeceflower)为蓼科草本植物虎杖的干燥根茎和根，其性苦，微寒，具有活血解毒，利湿退黄之功效。现代研究显示虎杖具有抗炎、改善糖脂代谢、抗AS和血栓形成等药理学作用[5]。虎杖兼具传统中医学活血解毒之功效和现代药理学抗炎、调脂等作用，在AS的防治领域得到广泛关注，本课题组前期开展了活血解毒中药虎杖防治AS易损斑块的实验研究，初步发现其稳定AS易损斑块的效应明显优于单纯活血中药三七和单纯解毒中药黄连[6]，但目前对虎杖治疗AS的药效物质基础和作用机制仍缺乏系统性认识，有待进一步深入研究。

网络药理学是2007年Hopkins率先提出的药物研发新理念[7]，其整体性、系统性的优势为多成分、多靶点的中药复杂系统研究提供了新的思路和策略[8]。本研究基于网络药理学方法，筛选虎杖治疗AS的活性成分，预测其潜在分子机制，以期初步阐释虎杖治疗AS的药效物质基础及作用机制，为深入开展虎杖治疗AS的基础研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 虎杖活性成分与潜在靶点筛选 利用北京蛋白质组研究中心开发的生物信息学工具BATMAN-TCM平台(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索虎杖活性成分，筛选活性成分潜在靶点基因。BATMAN-TCM是目前功能最为全面的中药作用机制在线分析工具，其基于药物-药物相似性和蛋白-蛋白相似性算法预测中药活性成分的潜在靶点[9]。检索参数设置为Score cutoff≥20，P-value cutoff<0.05，建立虎杖活性成分-靶点基因数据库。

1.2 动脉粥样硬化疾病靶点文本挖掘 利用PALM-IST平台(http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/)检索AS相关靶点基因，PALM-IST是基于PubMed文本挖掘的信息检索工具，其可通过关键词检索对PubMed数据库所收录文献中的相关疾病靶点基因进行批量文本挖掘，从而实现疾病靶点的获取。以“atherosclerosis”为关键词进行文本挖掘。

1.3 成分—靶点网络构建与分析 获得虎杖活性成分潜在靶点基因及AS靶点基因后，取两者交集并进行药物成分靶点-AS疾病靶点映射，利用Cytoscape 3.2.1软件构建“活性成分-作用靶点”网络并进行可视化，药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示，利用network analyzer 插件进行网络拓扑结构分析，计算节点自由度(degree)、介数(betweenness centrality)、接近中心性(closenesscentrality)、平均最多路径长度(average shortest path length)等参数，根据节点自由度筛选主要靶点基因并导入STRING数据库(https://string-db.org/)，绘制主要靶点基因的相互作用网络。

1.4 基因富集分析 利用FunRich 3.1.3软件(http://www.funrich.org/)进行基因富集分析，FunRich是2015年发布的一款基因富集和网络互作分析工具，其通过整合Uniprot、PPD、Gene ontology、KEGG、Reactome、Cellmap、NCI nature等10余个生物信息数据库的基因组和蛋白质组数据，形成了超过150万条注释的背景数据库，较传统基因功能分析工具如Ingenuity PathwayAnalysis、MetaCore、DAVID等具有界面友好、多源信息集成和图形可视化等诸多优势[10]。通过FunRich中的“Gene enrichment”模块完成生物学过程(biological process)和生物信号通路(biological pathway)富集分析及图形可视化。

2 结 果

2.1 虎杖治疗动脉粥样硬化的活性成分与潜在靶点 经BATMAN-TCM平台检索，共获得虎杖化学成分70个，其中43个成分具有化学结构和预测靶标，经PALM-IST文本挖掘，共获得人类AS靶点基因4 163个，取虎杖靶点基因和AS靶点基因交集后，共获得虎杖治疗AS的潜在靶点基因160个，具有治疗AS作用的活性成分21个。详见表1。

2.2 成分—靶点网络及靶点互作分析结果 将虎杖活性成分和作用靶点信息导入Cytoscape 3.2.1软件，构建虎杖治疗AS的“活性成分-作用靶点”网络图，共包含181个节点(21个成分靶点，160个基因靶点)、316条边，绿色圆形节点代表虎杖活性成分，蓝色矩形节点代表作用靶点，详见图1。用network analyzer 插件进行网络拓扑结构分析，得到潜在靶点基因的自由度，自由度越大则表明通过该靶点发挥作用的可能性越大，自由度≥5的重要靶点基因有PTGS2、PTGS1、PGR、ESR1、ALOX5、VDR、SOX9和MED1，其在网络中的具体参数信息详见表2，相互作用关系见图2。

2.3 基因富集分析 将虎杖治疗AS的160个潜在靶点基因导入FunRich完成生物学过程和信号通路富集分析，生物学过程富集分析发现P<0.05的生物学过程涉及信号转导(signal transduction)、细胞通讯(cell communication)、能量通路(energy pathways)和代谢(metabolism)，详见图3；信号通路富集分析发现P<0.05的生物信号通路包括维甲酸受体(retinoic acid receptors， RARs)信号通路、维甲酸X受体(retinoic X receptors，RXRs)RXRs和RARs异源二聚体核因子信号通路、生物胺受体信号通路、G蛋白偶联受体信号通路、肾上腺素能受体信号通路、视紫红质样受体信号通路、经典NF-kappaB信号通路、白介素23(interleukin-23，IL-23)信号通路、TAK/NF-kappaB信号通路、CD40/CD40L信号通路、白介素12(IL-12)信号通路、TLR3/TRIF信号通路、TRAF6/NF-kappaB信号通路、Aurora A激酶信号通路、脂质与脂蛋白代谢通路、白细胞分化的转录调控通路、前列腺素受体信号通路和TLR信号通路等，详见图4。

表1 虎杖中21个具有治疗AS作用的活性成分

图1 虎杖治疗AS活性成分-作用靶点网络图

表2 自由度≥5的潜在靶点基因

图2 自由度≥5的潜在靶点基因相互作用网络图

图3 虎杖活性成分治疗AS潜在靶点的生物学过程

图4 虎杖活性成分治疗AS潜在靶点的生物信号通路

3 讨 论

虎杖药用历史悠久，入药始见于《雷公炮炙论》，传统中医多取其利湿退黄、清热解毒、活血散瘀之功效，广泛应用于湿热黄疸、痈肿疮毒、癥瘕和跌打损伤等病证。随着对虎杖化学成分和药理研究的不断深入，发现其主要含有二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类、香豆素类以及脂肪酸类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、调脂、抗血栓、改善血液流变学、扩张血管、保护心肌等广泛的药理学作用[11]。近年来，虎杖在AS的临床治疗和药理研究中亦展现出较高的应用价值和良好的开发前景。本研究应用网络药理学方法，首次系统性地探索了虎杖治疗AS的活性成分、潜在靶点基因和分子机制。

本研究共发现具有治疗AS作用的虎杖活性成分21个，其中3，5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸(3，5-dimethyl-4-methoxybenzoic Acid)、反式白藜芦醇(trans-resveratrol)、白藜芦醇(resveratrol)、蒽醌(anthraquinone)、大黄素(emodin)、大黄酸(rhein)、大黄素蒽酮(emodin anthrone)、皂皮酸(quillaic acid)、远志酸(polygalacic acid)和没食子酸(Gallicacid)等化学成分能作用于10个以上的AS靶点基因，可认为是虎杖治疗AS的主要活性成分。从活性成分—作用靶点网络图中可以看出同一活性成分可对应不同的靶点，不同活性成分也可对应相同的靶点，体现出虎杖多成分、多靶点治疗AS的作用特点。既往已有大量实验研究表明上述多种药效成分具有良好的抗AS作用，其中，以白藜芦醇和反式白藜芦醇的研究最为广泛和深入，白藜芦醇是虎杖中含量较高的一种二苯乙烯类化合物，反式白藜芦醇是白藜芦醇的同分异构体，具有与白藜芦醇相同的生物活性，白藜芦醇及其衍生物因良好的抗炎、抗氧化、抗衰老和血管保护等作用，被广泛应用于AS的辅助治疗中[12]。实验研究显示白藜芦醇及其衍生物可通过多种途径发挥抗AS作用，如白藜芦醇可通过抑制NF-kappaB、MAPK信号通路发挥抗炎、降脂和抗AS作用[13-14]；通过下调TRPC1及STIM1基因表达及蛋白水平，抑制SOCC介导的Ca2+内流，增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及活性[15]；还可通过诱导巨噬细胞自噬延缓AS进展[16]；反式白藜芦醇可减少血管壁炎性细胞的招募和炎性趋化因子的表达[17]。大黄素、大黄素蒽酮和大黄酸同属于大黄蒽醌类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等生物活性[18]，大黄蒽醌类在虎杖中亦有较高的含量，是虎杖的主要特征性成分[19]；大黄素能够增加ApoE-/-小鼠易损斑块中过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARγ)的表达，降低粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，增加斑块稳定性[20]；可通过ROS-ERK1/2/p38信号通路上调PPARγ的表达，抑制血管平滑肌细胞C反应蛋白(CRP)的表达[21]；还可通过抑制脂质过氧化发挥抗AS作用[22]。3， 5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸、皂皮酸、远志酸和没食子酸等均属于有机酸类化学成分，其中3，5-二甲基-4-甲氧基苯甲酸可作用于65个AS靶基因，研究表明中药有机酸类成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化等广泛的药理学作用，在AS等心血管疾病中具有较高的潜在应用价值[23]，虎杖有机酸类成分的抗AS效应机制值得进一步深入探索。

经靶点映射，共获得虎杖治疗AS的潜在靶点基因160个，经网络拓扑结构分析，筛选出PTGS2、PTGS1、PGR、ESR1、ALOX5、VDR、SOX9和MED1等8个重要基因，且8个基因之间存在明确的相互作用关系，上述基因的相互作用及其下游信号通路有望成为虎杖治疗AS的潜在靶点。根据基因生物学过程富集分析结果推测，虎杖活性成分可参与细胞信号转导、细胞通讯、能量通路和代谢等4个生物学过程。根据基因信号通路富集分析结果推测，虎杖活性成分可能通过调控18条生物信号通路中的某些关键分子发挥抗AS作用。上述多条信号通路与炎症反应相关，其中经典NF-kappaB信号通路、TAK/NF-kappaB信号通路、TLR3/TRIF信号通路、TRAF6/NF-kappaB信号通路、TLR信号通路、CD40/CD40L信号通路、IL-23信号通路和IL-12信号通路均属于Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)家族及其介导的下游信号转导系统。TLRs属于模式识别受体，迄今为止，在人类基因组中已发现10个TLRs，TLRs不仅在天然免疫中发挥重要的作用，而且还调节获得性免疫，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[24]。TLRs识别各种外源性和内源性配体后，其胞内尾状结构域与接头蛋白髓样分化因子88(MyD88)结合，然后MyD88与IRAK家族相互作用募集TRAF6，激活NF-kappaB和MAPK信号通路，进而促进炎症因子的分泌[25]。TLRs与AS具有密切关系，TLRs激活后可通过促进白细胞浸润、促进脂质核心形成、促进纤维帽变薄和促进血管新生等导致AS斑块易损性增加[26]，推测虎杖可能通过调控TLRs受体信号系统中多个靶点和环节，参与多种病理生理过程，进而发挥抗炎、抗AS作用。维甲酸受体信号通路也是虎杖治疗AS的重要潜在信号通路，目前已鉴定的维甲酸受体有RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ和RXRγ等，分别属于RARs和RXRs两个不同核配体激活的转录调节因子超家族，维甲酸受体与维甲酸及其衍生物结合后被激活，通过维甲酸信号通路发挥生物学效应[27]，在AS中，维甲酸能够通过维甲酸受体信号通路作用于血管内皮细胞凋亡、血管平滑肌细胞增殖、氧化应激、炎症浸润等AS发生发展的关键环节，进而抑制斑块形成[28]，虎杖活性成分是否具有类维甲酸样效应发挥抗AS作用值得进一步探索。此外，脂质与脂蛋白代谢通路、前列腺素受体信号通路等在介导虎杖抗AS中的作用亦有待进一步研究。

综上所述，本研究基于网络药理学研究思路，整合应用多种生物信息学工具，对活血解毒中药虎杖多成分、多靶点、多途径治疗AS的复杂网络关系进行了系统研究，初步探索和预测了其治疗AS的药效物质基础与分子生物学机制，为后续实验研究进一步验证其作用机制提供了依据，也为更加复杂的活血解毒中药复方治疗AS的作用机制研究提供了借鉴。