清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏超声指标及病理学形态的影响

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高血压发病率与心血管疾病的发病率及死亡率呈正相关，而心血管疾病已成为全球首要死亡原因[1]。高血压因其高发病率、高致残率，难治疗，成为科研人员关注的焦点。研究发现高血压导致的靶器官损害是导致病人器官功能衰竭、死亡的根本原因。因此，高血压治疗的重点不仅在于降压，减轻其重要靶器官：心脏、肾脏、脑、血管的损害是治疗的关键[2]。本研究观察清达颗粒对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血压、心脏病形态及心功能的影响，评估该方控制血压和改善靶器官损害的效果，并为进一步研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级雄性SHR 12只，16周龄，体质量(350±20)g；健康SPF级雄性Wistar大鼠6只，16周龄，体质量(450±20)g，均由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。置SPF级实验室中正常喂养，恒温、恒湿，每天光照12 h。

1.2 主要仪器和试剂 CODATM无创血压仪(美国Kent)；Vevo®2100彩色多普勒超声诊断仪购于美国FUJIFILM VisualSonics；HE染色剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；Masson染色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)；QWin V3病理图像分析系统(德国Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及给药 适应性喂养1周后，将12只SHR随机分成模型组(SHR组)、清达颗粒组(SHR+QDG组)，6只Wistar作为空白组(Wistar组)。按照《药理实验方法学》换算给药剂量灌胃给药，依照体表面积折算系数，人与大鼠的折算系数为0.018，计算清达颗粒给药剂量为0.8 g/(kg·d)，给药量1mL，空白组、模型组给予等量生理盐水，干预8周。

1.3.2 测量血压、体质量 动物先在福建中医药大学实验动物中心进行为期1周的适应，在此期间对动物进行称重，使用CODATM无创血压仪，采用体积压力传感器技术(VPR)测量SHR大鼠尾动脉的收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、平均压(mean blood pressure，MBP)，并做好记录。具体操作如下：①将一个闭塞套套在距离鼠尾根部大约1 cm的位置。②将容积压力传感器(VPR)套在鼠尾上，到达位置为传感器无法再往鼠尾根部方向推动为止；在闭塞套和VPR传感器中充气，直至闭塞套完全阻断了鼠尾的血流，开始放气，这时随着放气，鼠尾动脉慢慢打开，至有血流从动脉流入鼠尾，这时鼠尾的容积开始改变，容积压力传感器感受到鼠尾容积开始变大，鼠尾容积开始变化的这一点鼠尾的压力便是收缩压；继续放气，动脉完全打开，静脉也开始打开有回血流经鼠尾。在静脉打开的瞬间，容积压力传感器感应到的鼠尾容积变化的斜率最大，鼠尾容积变化斜率最大时刻鼠尾压便为舒张压。③设置电脑软件，每次15个循环，共测3次，可获取相应数值，然后从中挑选至少3次连续血压值相近数值，最后取其平均值。

1.3.3 超声心动图检查 给药结束后进行超声心动图检查。异氟烷持续吸入麻醉，将大鼠固定在超声检测台上，用脱毛膏轻轻去除胸部毛发。用彩色多普勒超声诊断仪检测左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVIDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVIDs)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)、收缩末期室间隔厚度(IVSs)、舒张末左心室后壁厚度(LVPWd)、收缩末左心室后壁厚度(LVPWs)，并计算左室重量(LVM)、射血分数(EF)和心肌缩短分数(FS)。

1.3.4 HE染色 清达颗粒干预8周后，大鼠注射2%戊巴比妥钠液麻醉后，将心脏完整取出，用生理盐水冲洗干净残余的血液，在冰块上仔细去除大血管及心包组织，沿室间隔去除心房，只保留心室，再剪去心尖，暴露出左右心室，心室置于4%多聚甲醛内进行固定。次日弃原固定用的4%多聚甲醛，于持续缓慢的流动水下冲洗3～4 h后进行酒精梯度脱水，二甲苯透明组织，石蜡浸蜡包埋；整修包埋的组织蜡块，于切片机中进行切片，切片厚度约4 μm，将切片铺于40 ℃恒温水中展片，充分展片后平贴于载玻片上，于37 ℃烘片机上过夜干燥。将烘干后的石蜡切片用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱蜡至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，无水乙醇Ⅰ15 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，依次95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，超纯水冲洗3 min，冲洗2次，然后行HE染色。心脏在苏木素染液中染色3 min，1%盐酸酒精溶液分化3 s，流动的自来水冲洗10 min，0.5%水溶性伊红溶液中染色80 s。最后切片常规风干，中性树胶封片，光学显微镜下观察心脏心肌形态学变化。

1.3.5 Masson染色 将烘干后的石蜡切片用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱蜡至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，无水乙醇Ⅰ15 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，依次95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，超纯水冲洗3 min，冲洗2次，然后行Masson染色。Weigert氏铁苏木素染色5 min，用盐酸酒精分化，流水冲洗3次，返蓝液返蓝3 min，丽春红染色5 min，蒸馏水洗3次，弱酸分化1 min，磷钼酸分化3 min，弱酸分化1 min，直接苯胺蓝染色3 min，弱酸分化1 min，蒸馏水洗3次，常规风干，中性树胶封片。在光学显微镜下进行观察，同时比较选取视野范围区域内左室心肌组织细胞间质、壁内小动脉周围胶原纤维变化，并计算胶原蛋白容积分数(collagen volume fraction，CVF)及心肌小动脉血管周围胶原面积与管腔面积比值(perivascular circumferential area，PVCA)。

2 结 果

2.1 清达颗粒对SHR血压的影响 给药前，SHR组收缩压、舒张压及平均压与Wistar组比较差异有统计学意义(P<0.05)；SHR组与SHR+QDG组比较差异无统计学意义。第4周后，SHR+QDG组收缩压、舒张压及平均压较SHR组显著下降(P<0.05)，提示清达颗粒可以有效抑制SHR血压升高。详见图1。

与Wistar组比较，*P<0.05；与SHR组比较，#P<0.05

2.2 清达颗粒对SHR LVID、IVS、LVPW、左心室重量及功能的影响 SHR组IVSd、IVSs与Wistar组比较差异无统计学意义，SHR+QDG组IVSd、IVSs与SHR组比较差异无统计学意义；与Wistar组比较，SHR组LVIDd、LVIDs显著缩小(P<0.05)，但SHR+QDG组与SHR组比较差异无统计学意义；与Wistar组比较，SHR组LVPWd及LVPWs显著增厚(P<0.05)，SHR+QDG组LVPWd及LVPWs明显低于SHR组(P<0.05)；与Wistar组比较，SHR组LVM显著增大(P<0.05)，SHR+QDG组LVM较SHR组显著下降(P<0.05)；各组间EF和心肌FS比较差异无统计学意义。提示清达颗粒可以有效改善高血压造成的心脏重塑，对SHR心脏具有保护作用。详见图2。

与Wistar组比较，*P<0.05；与SHR组比较，#P<0.05

2.3 清达颗粒对SHR心脏病理形态的影响

2.3.1 HE染色显示 Wistar组心肌细胞排列整齐，横纹结构清晰，细胞核大小均一，胞浆染色均匀，心肌细胞无变性、坏死。与Wistar组比较，SHR组大鼠心肌细胞明显增大，部分心肌细胞肿胀变性，排列紊乱、断裂，胞核浓缩深染、胞浆染色加深，横纹结构不清，并见炎性细胞浸润现象。清达颗粒组大鼠心肌病理性改变有所改善。详见图3。

2.3.2 心肌Masson染色显示 心肌胶原纤维呈蓝色，心肌肌纤维呈红色。Wistar组大鼠结构正常，心肌肌束间可见少量胶原蛋白染色。SHR组大鼠可见心肌间质大量深染的胶原蛋白沉积，CVF显著高于Wistar组(P<0.05)。SHR+QDG组大鼠心肌组织胶原蛋白沉积明显减轻，CVF显著低于SHR组(P<0.05)。详见图4。

2.3.3 心肌壁内小动脉Masson染色显示 Wistar组大鼠心肌壁内小动脉周围可见少量胶原蛋白染色。SHR组大鼠壁内小动脉管壁增厚，中膜周围及中膜内可见大量胶原蛋白沉积，PVCA显著高于Wistar组(P<0.05)。SHR+QDG组大鼠壁内小动脉周围胶原蛋白沉积明显减轻，PVCA显著低于SHR组(P<0.05)。详见图4。

图3 清达颗粒对SHR心肌病理形态改变的影响(HE染色，400倍)

与Wistar组比较，*P<0.05；与SHR组比较，#P<0.05

3 讨 论

高血压是临床上的常见病、多发病，并且发病率随着年龄的增长呈上升趋势。2014年调查发现，我国高血压患病率高达29.6%，知晓率、治疗率和控制率分别为42.6%、34.1%和9.3%。据相关数据统计，在我国由于高血压引起的各种疾病中，心脏及脑血管病分别位于40 岁以上人群死亡原因的第1位和第3位。因此合理有效的降压措施对于降低高血压相关疾病的发生、发展具有重要意义。研究发现，高血压发病的早期以肝阳上亢证居多，热灼阴伤，则出现肝肾阴虚、肝阳上亢的症状。阳亢经久不愈，肾阴亏耗，发展为阴虚。阴阳互消互长，阴虚则导致肾阳虚衰，而成阴阳两虚之证候，最终多以卒中为结局[3]。现代医学大多认为高血压以肝肾阴虚，痰浊阻滞为中心病理环节，大致分为肝阳上亢型、阴虚阳亢型、肾精不足、阴阳两虚型、痰湿内蕴、瘀血阻窍、冲任失调型等7种类型。老年高血压病根据其临床表现，则可分为中气不足、肾阴虚、命门火衰、肝阳上亢、心脾两虚、痰湿中阻、气滞血瘀7种类型[4]。

左室肥厚是高血压心脏病最典型变化，是高血压引起心室重构的结果，主要包括功能重构、电重构和结构重构3方面。早期以向心性肥厚为标志性特征改变。高血压左室肥厚形成机制十分复杂，涉及遗传、环境、细胞内外各种刺激因子。血流动力学改变在左室肥厚发生、发展过程中起重要作用[5-6]。高血压病人心肌构造组织的胶原蛋白增多，小动脉构造周围的胶原面积与管腔面积比值会增大，心肌纤维化的程度就会增强，导致心室重构，引发心肌梗死、心肌缺血等心脏病变。因此改善高血压引起的左室重构具有重要意义[7-8]。

清达颗粒是由清眩降压汤精简而来。清眩降压汤是陈可冀院士60多年来治疗高血压的经验方剂，可以明显抑制血压升高，改善高血压造成的心、脑、肾等重要靶器官的损伤[9-13]。清达颗粒是由天麻12 g、钩藤10 g、黄芩6 g、莲子心5 g组成，主要治疗高血压病肝肾阴虚或阴虚上亢证病人。君药天麻平肝潜阳，辅以钩藤，助天麻清热平肝熄风，黄芩清肝热，莲子心泄心火，从而使肝之浮阳潜藏，心肝火热得降，达到潜肝平阳，抑制动风之功效，符合中医药治疗肝阳上亢高血压的治则。

本研究发现，SHR组大鼠血压较Wistar组血压升高，并出现左心室肥厚及高血压的心脏病理改变，而与SHR组比较，SHR+QDG组大鼠血压逐渐下降，左心室肥厚和心肌间质纤维化程度也得到改善。同时，对比心脏超声结果显示，SHR组大鼠左心室内径显著缩小，左心室后壁厚度则显著增厚，呈现典型向心性心肌肥厚的特点，而SHR+QDG组大鼠左心室内径未见显著改善，左心室后壁厚度则显著变薄，高血压引起的心脏向心性肥厚症状则有所改善，且超声结果与心脏HE、Masson染色结果相符。因此，清达颗粒改善心脏重构的机制可能与降低压力负荷有关。

综上所述，清达颗粒能够抑制心肌细胞重塑，逆转心肌肥厚，降压的同时具有明显的靶器官保护作用。其作用机制可能是降低压力负荷，减少机械牵张刺激。但其药理作用是否还涉及其他作用靶点和通路还需进一步研究。深入研究清达颗粒的作用机制，对于开展靶向药物治疗及指导临床用药具有深远的意义。