响应面试验优化超声波辅助提取龙眼愈伤组织中单宁的工艺

刘生财，段俊朋，姚德恒，林玉玲，赖钟雄

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002）

龙眼（Dimocarpus longan Lour）属于无患子科龙眼属，是我国著名的热带亚热带特色水果之一，也是我国传统名贵中药材，素有“南方人参”的美誉，是国家卫生部公布的法定药食两用植物，富含单宁、萜类、甾醇、多酚、类黄酮等多种次生代谢物质［1-2］，具有很高的营养价值和药用功能。

单宁又名植物多酚，广泛存在于植物的皮、根、叶、核和果肉中，具有抗癌、抗肿瘤、抗艾滋病和降压等功效［3-4］。近年来，关于各种植物单宁提取工艺研究的报道较多，单宁的常用提取方法有水浴提取法、超声波辅助提取法、超临界CO2萃取法、微波提取法等［5］。选择适宜的提取方法，可提高单宁的提取量，提高植物利用率，降低成本。超声波提取法相对于其他方法具有简便快捷、提取温度低、能耗低等优点，是一种较理想的单宁提取方法，广泛应用于多种植物材料的提取［6-10］。

根据植物细胞全能性理论，利用愈伤组织可生产植物次生代谢产物，例如多糖［11］，但对龙眼愈伤组织中单宁提取的研究尚未见报道。龙眼胚性愈伤组织能够长期继代培养，且在短时间内就可以获得大量材料［12-13］，通过龙眼愈伤组织提取单宁，不仅为单宁提取提供了新的来源，而且能够提高龙眼的综合利用价值。本研究以龙眼愈伤组织细胞为原料，对超声波辅助提取单宁物质进行优化，旨在探索一种快速、简便、高效的龙眼愈伤组织细胞单宁提取方法，为工业化生产单宁奠定基础、提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

龙 眼‘ 红 核 子 ’（Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi）胚性愈伤组织由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。将材料置于60℃电热恒温干燥箱中烘干，粉碎后过40目筛，密闭保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品量的测定

准确称取0.100 0 g单宁酸，溶解并定容1 000 mL，制成0.1 mg·mL-1的单宁酸标准溶液。准确吸取单宁标准溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于盛有15.0 mL蒸馏水的50.0 mL试管中，摇匀；加Folin-Denis试剂2.0 mL，摇匀；静置6 min后，再加入5.0 mL饱和Na2CO3溶液，用蒸馏水定容，摇匀，静置避光显色60 min，以不加单宁标准溶液为空白对照，在760 nm处测其吸光度值，绘制标准曲线。准确称取粉碎好的龙眼愈伤组织粉末0.200 0 g，置于50 mL试管中，加入60%的乙醇12 mL，在超声波功率120 W、温度60℃条件下超声1 h，过滤得到待测溶液，按上述方法测定吸光值。根据标准曲线计算样品的单宁量。

1.2.2 单宁量的结果计算

式中，C为显色溶液的单宁浓度（µg·mL-1）；V为显色溶液体积（mL）；V0为样品提取液体积（mL）；V1为测定时吸取样品溶液体积（mL）；m为龙眼愈伤组织质量（g）。

1.2.3 精密度试验

准确吸取0.1 mg·mL-1的单宁酸标准溶液1.0 mL，在760 nm处测其吸光度，重复5次，求得RSD。

1.2.4 加标回收率实验

准确移取0.5 mL同一样品溶液5份，分别加入1.25 mg单宁酸，在760 nm处测其吸光度，重复5次，求得RSD。

1.3 单因素试验

以乙醇作为提取溶剂，探讨提取溶剂浓度、超声波时间和超声波功率对龙眼愈伤组织中单宁提取效果的影响。

1.3.1 提取溶剂浓度

以乙醇为提取溶剂，研究不同浓度乙醇溶液对龙眼愈伤组织中单宁提取效果的影响。乙醇浓度设置为40%，50%，60%，70%，80%和90%共6个梯度，超声波功率设置为120 W，提取温度60℃，超声波提取60 min，料液比1：60。 每种处理设置重复3次。

1.3.2 超声波提取时间

超声波功率120 W，提取温度60℃，乙醇溶液浓度为 60%，料液比 1：60，设置 30，45，60，75和 90 min 5个提取时间，研究不同提取时间对龙眼愈伤组织中单宁提取效果的影响。每种处理重复3次。

1.3.3 超声波功率

提取时间45 min，提取温度60℃，乙醇溶液浓度为60%，料液比1：60，设置超声波功率为80，100，120，140和160 W 5个梯度，比较不同超声波功率对龙眼愈伤组织中单宁提取效果的影响。每种处理重复3次。

1.4 响应面试验设计

通过单因素试验分析，应用Design-Expert 8.0.6 软件，根据 Box-Behnken［14］设计原则，以乙醇浓度、超声波功率和提取时间为3个影响因素，以单宁提取量为响应值，设计三因素三水平的响应面试验，最终根据响应面试验结果，确定龙眼愈伤组织单宁的最佳提取工艺，响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 结果与分析

2.1 精密度试验

准确吸取0.1 mg·mL-1的单宁酸标准溶液1.0mL，在760 nm处测其吸光度值，重复5次，求得RSD=0.054 8%＜2.0%，表明仪器精密度良好。

表2 精密度实验结果（n=5）Table 2 Result of precision experiments（n=5）

2.2 加标回收实验

由表3可知，加标回收试验的平均回收率为99.84%，RSD为0.357%＜2.0%，说明该测定方法具有很好的准确度。

表3 回收率试验结果（n=5）Table 3 Result of recovery experiments（n=5）

2.3 单宁标准曲线

以单宁酸浓度为横坐标（x），测得的吸光值（A）为纵坐标（y），绘制标准曲线，y=67.683x+0.006 3（R2=0.999 1），呈现良好的线性。

图1 单宁标准曲线Fig.1 The standard curve of the tannin

2.4 单因素试验对龙眼愈伤组织中单宁提取的影响

由图2（a）知，随着乙醇浓度的升高，龙眼愈伤组织中单宁提取量先升高后降低。乙醇浓度在60%时，单宁提取量最高达到6.12 mg·g-1，表明龙眼愈伤组织中单宁提取最佳乙醇浓度为60%。

由图2（b）知，随着提取时间的延长，龙眼愈伤组织细胞单宁量也随之增加，45 min时提取量最高，为6.51 mg·g-1，随着时间进一步延长，单宁提取量开始下降。说明在一定时间范围内，延长超声波提取时间有利于单宁的提取，可能是因为超声波作用使细胞破碎更充分，使单宁物质易于提取；当时间过长时，提取液温度升高，单宁发生氧化，导致提取量减少。因此本研究筛选的单宁最佳提取时间为45 min。

超声波可以破碎愈伤组织细胞，有利于单宁物质从细胞中溶出。由图2（c）知，随着超声波功率的增大，龙眼愈伤组织细胞单宁量也随之增加，并在120 W时提取量达到最高，为6.93 mg·g-1，随着功率的进一步增大，单宁提取量逐渐降低。说明超声波功率偏低时，对龙眼愈伤组织细胞的破碎作用不充分，单宁的溶出率有限；随着超声波功率的增大，“空化效应”增强，改善了溶液中单宁的溶出效果，但当超声波功率过高时，放出的热量，会加速溶液中单宁的氧化。因此，本研究确定的最佳超声波功率为120 W。

图2 单因素处理对单宁提取量的影响Fig.2 Effect of single factor on tannin content

2.5 响应面优化试验结果分析及条件优化

2.5.1 超声波辅助提取龙眼愈伤组织中单宁量的响应面试验

利用超声波辅助提取龙眼愈伤组织中单宁的方法，对提取条件中的乙醇浓度（A）、超声波功率（B）及提取时间（C）与单宁提取量设计了17组响应面实验，测量每组实验的单宁量（见表4），然后利用Design-Expert 8.0.6软件对表4中的数据进行分析，得到二次多项式回归方程：

表4 Box-Behnken试验方案及结果Table 4 Box-Behnken experimental design arrangement and results

由表5可知，该模型具有高度显著性（p＜0.000 1），决定系数R2=0.979 8，失拟项不显著（p=0.550＞0.05），表明该回归模型拟合度好，实验值与预测值比较接近，因此可以用此模型对超声波提取龙眼愈伤组织细胞单宁的工艺参数进行分析和预测。 方差分析结果中，B、C、A2、B2、C2对单宁的提取量有极显著影响（p＜0.000 1），AC为显著影响因素，A和AB影响不显著。说明回归方程具有较好的拟合度。因此，可用该模型代替真实试验点对试验结果进行分析和预测。

表5 回归方程方差分析表Table 5 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

利用Design-Expert 8.0.6软件绘制能反映影响单宁提取量的3个因素交互作用的二维等高线图和三维响应面图，如图3（a）～（c）所示。 响应面坡度陡峭程度和等高线椭圆形状反映了交互作用强弱趋势。其中，坡度平缓表示两因素交互作用不显著，坡度陡峭表示两因素交互作用显著；圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著。 从图3（a）可以看出，乙醇浓度A与超声波功率的交互作用对龙眼愈伤组织单宁提取量无影响，而乙醇浓度A和提取时间C（图3（b））与超声波功率B和提取时间C（图3（c））的交互作用对龙眼愈伤组织单宁提取量有显著影响。

由图3（b）知，固定超声波功率B在0水平时，乙醇浓度A在60%、提取时间C在48 min以内对龙眼愈伤组织单宁提取量的影响呈显著（p＜0.05）正相关交互关系；反之，当乙醇浓度A高于60%、提取时间C大于48 min时，二因素的交互作用对龙眼愈伤组织单宁提取量的影响具有显著（p＜0.05）负相关交互关系。当乙醇浓度较低时，随着浓度的升高，由于“相似相溶”原理，可以提高单宁的提取量，此外，提取时间适当延长也有利于龙眼愈伤组织中单宁物质的溶出，当二者在一定范围内同时增大时，由于协同作用龙眼愈伤组织单宁提取量增加更明显；但当乙醇浓度过高时，导致水解单宁组分不能完全溶出，对提取量造成影响，而提取时间过长会导致部分单宁氧化分解。因此，在一定范围提高提取温度，加大乙醇浓度有助于提高龙眼愈伤组织单宁的提取量，但当乙醇浓度过高、提取时间过长时，反而会降低单宁的提取量。

由图3（c）知，当乙醇浓度A固定在0水平时，超声波功率B在140 W、提取时间C在54 min以内时，二因素的交互作用与龙眼愈伤组织单宁提取量呈极显著（p＜0.01）正相关交互关系；反之，当超声波功率B超过140 W、提取时间C大于54 min时，与龙眼愈伤组织单宁提取量呈极显著（p＜0.01）负相关交互关系。当超声波功率较低时，随着功率的增大，空化作用增强，分子的扩散速度增大，有利于提高单宁的提取量。此外，适当延长提取时间也有利于龙眼愈伤组织中单宁物质的溶出，当二者在一定范围内同时增大时，由于协同作用使龙眼愈伤组织单宁提取量增加更明显；但当超声波功率过高时，强烈的空化作用会导致单宁成分的分解，从而影响提取量，而长时间使用超声波会导致温度升高，单宁被氧化分解。因此，在一定范围内，增大超声波功率、升高提取温度有助于提高龙眼愈伤组织单宁的提取量，但当超声波功率过高、提取时间过长时又会降低单宁的提取量。

图3 分别以乙醇浓度和超声波功率（a），乙醇浓度和提取时间（b），超声波功率和提取时间（c）为函数时单宁量的反应曲面图Fig.3 Response surface plot of dannin content as a function of ethanol concentration and ultrasonic power（a），extraction time and ethanol concentration（b），and ethanol concentration and ultrasonic power（c）

2.5.2 响应面试验的最佳优化结果及验证

采用响应面分析方法，对龙眼愈伤组织单宁的超声波提取工艺进行了优化，得到的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60.78%、超声波功率140 W、提取时间53.44 min，此时单宁量的理论值为7.62 mg·g-1。但考虑到实际情况，将乙醇浓度调整为61%、超声波功率为140 W、提取时间为54 min。在此修正条件下进行龙眼愈伤组织中单宁的提取，重复3次，实际提取的单宁量为7.53 mg ·g-1，与理论预测值 7.62 mg·g-1的相对误差为2.0%（见表6），与预测值无统计学差异（p＞0.05），说明与实际提取量相吻合，该回归方程可靠，利用响应面优化法得到的龙眼愈伤组织细胞单宁提取条件真实有效。

表6 工艺验证结果Table 6 Result of confirmatory experiments

3 讨 论

利用超声波辅助法能高效提取龙眼愈伤组织中的单宁。超声波辅助提取法已广泛应用于植物有效成分的提取，该技术具有能耗低、效率高、用时短、成本低等优点［6-10，15］，同时相对于传统提取方法，超声波辅助法可避免长时间加热对生物活性物质的破坏，具保质作用［16］。

根据“相似相溶”原理，单宁一般采用水或有机溶剂作为浸提液。由于单宁的组成成分比较复杂，使用单一溶剂无法完全浸提出单宁，且水的极性大，会浸提出较多杂质影响后续分离提纯，因此，很少单独将水而是将含有机溶剂（如丙酮、乙醇、甲醇）的水溶液作为浸提液［5］。同时，乙醇较丙酮、甲醇等有机溶剂安全，已作为单宁提取溶剂应用于桑叶等材料中［17］。因此，本研究选择乙醇为提取溶剂，利用超声波辅助法进行龙眼愈伤组织中单宁成分的提取。

响应面分析法具有试验次数相对较少、实验精度较高的优点［18］。在优化得到的最佳工艺条件下测得的龙眼愈伤组织中单宁的量与理论值基本吻合，因而利用该方法得到的提取工艺具有实用价值，为龙眼愈伤组织细胞工厂化生产单宁提供了一定的科学依据。

愈伤组织具有增殖快、周期短和不受季节限制等特点［19］。根据植物细胞全能性理论，利用愈伤组织可以生产植物次生代谢产物，例如多糖［11］。而龙眼愈伤组织中单宁提取及量的测定尚未见报道。采用响应面法优化超声波辅助提取龙眼愈伤组织细胞单宁的工艺，经验证，该方法操作方便、提取量高、数据精确。