雷公藤红素对人急性早幼粒细胞白血病SCID小鼠移植瘤模型凝血功能的影响*

王 黎 秦桂芳 柯 鸿 魏广民

（1.湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院附属东风医院，湖北 十堰442000）

急性早幼粒细胞白血病（APL）在急性白血病中恶性程度较高，是一种外周血及骨髓中早幼粒细胞异常增多的造血组织恶性疾病［1-2］。急性早幼粒细胞白血病在急性髓系白血病中被分为M3型，其发病以35岁左右的年轻人居多，其主要病理特点是正常血细胞的制造被明显抑制，而骨髓及其他造血组织中白血病细胞无限制地大量增生并进入外周血液而致病［3-4］。内脏严重出血是导致急性早幼粒细胞白血病患者早期死亡的主要原因，其出血的原因包括抗凝及纤溶系统激活、凝血异常、血小板功能障碍及血管内皮损伤等［5-6］。目前，随着本病病理机制研究的深入，针对肿瘤特异性标志分子并应用诱导分化治疗，急性早幼粒细胞白血病已经从最凶险的白血病变成治愈率最高的白血病［7-8］。但患者因多种因素导致止、凝血异常，极易诱发弥漫性血管内凝血（DIC），使病情更为凶险，因此，研究引起内脏出血并进行有效治疗仍有一定的临床意义［9］。雷公藤红素是从雷公藤根皮中提取出的一种五环三萜类化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗纤维化、抗肿瘤血管生成等作用，在抗白血病方面也越来越受到重视［10-11］。目前对雷公藤红素抗癌和治疗风湿等方面的研究比较深入，但对急性早幼粒细胞白血病导致凝血功能异常方面却缺乏相应的研究，为纠正急性早幼粒细胞白血病止凝血功能异常，预防或治疗已出现的DIC现象，本研究观察和分析了雷公藤红素对人急性早幼粒细胞白血病重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠移植瘤模型凝血功能的影响，为临床可能用于辅助治疗提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SCID beige小鼠30只，雌雄各半，3～5周龄，体质量16.5～17.5 g，小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK2016-0031饲养于十堰市人民医院科技中心，在本中心标准实验室开展实验研究。动物饲养在层流架内无菌独立送风隔离IVC笼中，与鼠接触的一切物品、饲料和饮用水均须灭菌处理。实验中遵偱3R原则，给予SCID beige小鼠人道关怀，保证实验动物的福利。实验期间动物自由饮用灭菌双蒸水，饲以加有维生素C和鸡蛋的标准颗粒饲料，12 h交替光照，环境温度控制在22～24℃，相对湿度50%～75%。

1.2 试药与仪器 雷公藤红素标准品 （上海源叶生物，批号：34157-83-0）；人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4由十堰市人民医院科技中心冻存保种；胎牛血清和RPMI 1640（美国Gibco公司）；全自动血液分析仪由雷度米特医疗设备（上海）有限公司提供；C2000-A全自动凝血分析仪由北京普利生仪器有限公司提供。

1.3 分组与造模 30只小鼠随机取10只不造模，为对照组。另外20只制作模型。人急性早幼粒细胞白血病SCID小鼠移植瘤模型建立：先将冻存保种的人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4取出，于37℃条件下解冻后接种于含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，移入饱和湿度、恒温37℃并通5%CO2的隔离培养箱中培养和传代。然后待NB4细胞生长成熟后调至按5×106/mL的细胞溶液备用。接种时取20只SCID beige小鼠，采用尾静脉注射对数生长期的NB4细胞5×106个/只的方法建立人急性早幼粒细胞白血病SCID小鼠移植瘤模型［12］。将上述接种NB4细胞的20只SCID beige小鼠随机均分为模型组和实验组，每组10只。

1.4 干预方法 造模3周后实验组腹腔注射1%雷公藤红素0.1 mL/鼠治疗14 d，对照组和模型组腹腔注射等剂量0.9%氯化钠注射液作为阴性和阳性对照。

1.5 观察指标 凝血功能实验，在治疗前后每组取5只小鼠，剥除眼球，然后吸取眼底静脉血0.1 mL进行凝血功能实验。实验时采用双磁路磁珠凝固法观察小鼠凝血时间（CT）、采用断尾法观察出血时间（BT）［13］。凝血因子生成实验，参照文献［14］，采用凝血因子生成实验检测小鼠眼底静脉血内/外源性凝血因子Ⅹa。检测时准确吸取备用眼底静脉血100 μL加入含有130 nmol/L因子Ⅹ、5 nmol/L因子Ⅷ、1 nmol/L因子Ⅸa、5 mmol/L CaCl2和0.2 nmol/L凝血酶 （Ⅱa）的缓冲液中，37℃孵育，10 min后用7 mmoL/L的络合剂EDTA终止反应。加入0.8 mmol/L的显色底物，待反应中止后迅速上机，将酶标仪波长调至405 nm，读取内/外源性凝血因子Ⅹa的生成量。将取上述全血105个全血细胞与含5 mmol/L CaCl2、130 nmol/L因子Ⅹ和1 nmol/L因子Ⅶa的缓冲液中共孵育 10 min，用7 mmol/L的EDTA终止，然后加入0.8 mmol/L的显色底物测定外源性因子生成量。将105个全血细胞加入含 5 mmol/L CaCl2、1 nmol/L 因子Ⅴa、0.05 nmol/L 因子Ⅹa、1 nmol/L凝血酶原的缓冲液中共孵育10 min，用7 mmol/L的EDTA终止；加入0.8 mmol/L的S2238，用酶标仪在405 nm波长处测定凝血酶生成量。采用免疫渗滤胶体金显色反应法检测血清D-二聚体 （D-D）含量。采用瑞氏染色后显微镜下肉眼计数眼底静脉血白细胞计数和人早幼粒细胞阳性率。观察模型和实验组动物2个月生存时间。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，多组间均数检验先进行采用多因素方差分析，符合正态分布的组间两两比较采用t检验，不符合正态分布的组间两两比较采用校正LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组小鼠治疗前后外周血凝血功能指标比较 见表1。对照组治疗前后凝血功能指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组和实验组治疗前凝血功能指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组治疗后外周血凝血指标中CT、BT和APTT均较治疗前降低、DD、FIB 和内/外源性凝血因子Ⅹa升高 （P＜0.05）；而实验组治疗后 CT、BT和 APTT均延长（P＜0.05），DD、FIB和内/外源性凝血因子Ⅹa降低（P＜0.05），与模型组和治疗前比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组小鼠治疗前后外周血白细胞计数、人早幼粒细胞阳性率及生存时间比较 见表2。模型组和实验组治疗前外周血均出现白细胞计数和人早幼粒细胞阳性率，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前模型组和实验组小鼠外周血白细胞计数和人早幼粒细胞阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后模型组小鼠外周血白细胞计数和人早幼粒细胞阳性率较治疗前进一步升高，与治疗前和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组治疗后明显降低，但均未至对照组水平，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组治疗后与模型组同时期和治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.05）。经2个月生存时间观察，对照组无动物死亡，实验组平均生存时间为（49.48±6.14）d，明显高于模型组平均生存时间为（32.67±4.27）d，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组小鼠治疗前后外周血凝血功能指标比较（x±s）

表2 各组小鼠治疗前后外周血白细胞计数、人早幼粒细胞阳性率及生存时间比较（x±s）

3 讨 论

流行病学显示，临床上急性早幼粒细胞白血病并不少见，占同期急性白血病的18.7%左右，发病率比西方国家高10%，发病年龄中位数为30～38岁，10岁以下者较罕见［15］。急性早幼粒细胞白血病具有以下特点：病理学检测可见异常颗粒充满早幼粒细胞质内；出血倾向严重，出血的发生率高达72%～94%，诱发的弥漫性血管内凝血（DIC）是其主要死亡因素；高达90%的患者出现 t（15；17）（q22；q12）等特异性染色体改变；患者虽对化疗敏感，但早期死亡率偏高，10%～20%患者死于时期出血或DIC；三氧化二砷能诱导早幼粒细胞凋亡、维A酸能诱导其细胞分化成熟；随着对早幼粒细胞生物学的特性认识的不断提高及针对性治疗方法的改进，经治疗后病情持续缓解时间长，预后明显改善，早期因出血或DIC引起的死亡明显减少，死亡率明显下降［16］。急性早幼粒细胞白血病的病因复杂，有研究证实，早幼粒细胞质内存在大量的纤溶物质t-PA、u-PA和高活性促凝物质如CP、TF等，也存在大量蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等，随着白血病细胞被化疗破坏或增殖分化后，这类蛋白水解酶、纤溶活性及促凝物质大量释放入循环系统中，引起纤维蛋白溶解和DIC，患者因止、凝血功能异常，进而引起全身出血倾向或DIC现象［17-18］。由此可见，止、凝血异常诱发的出血倾向或DIC是急性早幼粒细胞白血病的主要死因。纠正止、凝血功能异常是防治出血倾向或DIC，挽救患者生命的重要环节。

雷公藤红素主要来源于卫矛科植物雷公藤的根皮，又称南蛇藤素，是一类具有很强的抗类风湿、抗氧化和抗癌症新生血管生成等多种生物学活性的生物碱，是治疗类风湿病中药制剂雷公藤多苷片、雷公藤片的有效成分之一［19］。多项研究表明，雷公藤红素的主要活性与药理作用有细胞毒活性、免疫调节、免疫抑制、抗炎、抗过氧化等作用［20］。雷公藤红素也是一种有效的蛋白酶体抑制剂，可通过抑制蛋白酶体活性进而诱发癌细胞凋亡、白血病化疗药物降低毒副作用并增强其敏感性［21］。

目前针对其对人急性早幼粒细胞白血病凝血功能的研究还属空白。笔者在本研究中发现，雷公藤红素可纠正SCID小鼠移植瘤小鼠止、凝血异常现象。如实验组治疗后外周血白细胞计数和人早幼粒细胞阳性率较治疗前和模型组降低、生存时间延长；凝血指标中CT、BT和APTT均延长，且DD、FIB和内/外源性凝血因子Ⅹa均降低。

在凝血过程中，机体存在内/外源性凝血途径。在外源性凝血途径中，参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜蛋白，当组织损伤后，组织因子释放，钙离子与因子Ⅶ形成1∶1的复合物，因子Ⅹ被激活，接着凝血酶激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，产生凝血作用，从而启动外源性凝血，而临床上常以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状况［22-23］。而内源性凝血途径是指参与凝血的因子全部来自血液，通常因血液与带负电荷的异物表面接触而启动。当血液与带负电荷的异物表面接触时，首先是FⅫ结合到异物表面，并被激活为FⅫa。FⅫa的主要功能是激活FⅪ成为FⅪa，从而启动内源性凝血途径。外源凝血途径和内源凝血途径可以相互活化，两者可能在急性早幼粒细胞白血病的病理进程中启动止凝血一系列连锁反应，在因子Ⅹ处汇合，引起凝血酶原激活及纤维蛋白的形成，从而引起出血或DIC的形成。雷公藤红素可能作用于这一环节，抑制引起内/外源性凝血途径的凝血因子DD、FIB和内/外源性凝血因子Ⅹa，干扰内/外源性凝血途径，而纠正急性早幼粒细胞白血病止、凝血功能障碍并防止DIC的发生。这也是SCID小鼠移植瘤小鼠在治疗后外周血白细胞计数和人早幼粒细胞阳性率较治疗前和模型组降低、生存时间延长的主因。

正常生理状态下，纤溶酶和抑制酶维持于动态平衡，而病理状态下，如组织损伤时机体发生凝血时，凝血酶作用于纤维蛋白使之转变为交联纤维蛋白，同时激活纤溶系统，纤溶系统激活后会降解纤维蛋白，形成各种碎片。r链能把2个含D片段的碎片连接起来形成DD。由此可见，DD水平的上升代表凝血机制被激活、凝血块在血液循环中形成。因此，DD升高可反映体内存在着凝血及纤溶活性增强，是凝血功能的重要分子标志物，也是急性白血病预后的重要标志物［24］。有临床报道雷公藤可降低早期糖尿病肾病患者血清DD水平［25］。这说明雷公藤对血清DD有一定的影响，但目前没有文献显示雷公藤可降低急性早幼粒细胞白血病血清DD。而本研究发现雷公藤红素可降低人急性早幼粒细胞白血病模型小鼠血清DD。但目前没有文献显示雷公藤红素可降低急性早幼粒细胞白血病患者血清DD，这可能是雷公藤红素影响凝血功能的新靶点。下一步将重点研究雷公藤红素对人急性早幼粒细胞白血病患者血清DD等与凝血功能相关的其他因子是否产生影响。