通腑平喘方对脓毒症急性肺损伤大鼠Keap1-Nrf2/ARE信号通路的影响*

杨丽梦 熊旭东

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021）

脓毒症（Sepsis）由于宿主对感染的反应失调而导致生命危险的器官功能障碍的临床综合征［1］。全世界范围内脓毒症发病率越来越高，其总体死亡率仍高达25%～45%［2］。在人体的各个器官中，肺是脓毒症多器官功能障碍综合征中最容易受损，也是最早受损的器官，其常见表现为急性肺损伤（ALI）或急性呼吸窘迫综合征（ARDS），而这却往往是患者的直接死亡原因［3］。 中医经典理论“肺与大肠相表里”是肺经与大肠经之间存在表里络属关系，疾病传变上相互影响。通过对脓毒症的长期临床观察及对其病因病机的认识，学界认为肺肠同治法对治疗脓毒症ALI患者有较好的临床疗效。本实验采用肺肠同治法，探讨通腑平喘方对脓毒症急性肺损伤大鼠抗氧化应激的保护作用，观察其对KeapⅠ-Nrf2/抗氧化物反应原件 （ARE）信号通路的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性清洁级SD大鼠40只，体质量210～230 g。购于上海中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（沪）2014-0008。

1.2 试剂与器材

血清丙二醛（MDA）（产品编号 S0131）、超氧化物歧化酶（SOD）（产品编号 S0101）、谷胱甘肽（GSH）（产品编号S0052）生化试剂盒，Nrf2酶联免疫分析试剂盒（批次201612）均购于上海富乐生物有限公司。荧光定量PCR试剂盒于上海纽思格生物科技有限公司购置。通腑平喘方药物组成：大黄10 g，芒硝10 g，桃仁10 g，葶苈子15 g，桑白皮10 g等。除芒硝和大黄外，用10倍体积的清水浸泡饮片30 min，用武火煮至沸腾后，再用文火煮20 min，最后加入大黄，煎10 min后熄火滤取煎液。第2煎加入6倍体积的清水，煮沸后文火再煎煮20 min，熄火滤取煎液。将2次煎煮的汤药混合用5层医用纱布滤渣，将芒硝加入滤液中，充分搅拌至溶解，最后将汤药浓缩至含生药1 g/mL。放置于4℃冰箱保存备用。

1.3 分组与造模

将40只成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常组、中药组、模型组及假手术组4组，每组10只。采用CLP制备脓毒症模型。正常组于6 h、12 h后予以0.9%氯化钠注射液灌胃。假手术组开腹后将盲肠取出后再回纳到腹腔，术后6 h、12 h予以0.9%氯化钠注射液灌胃。模型组CLP术后立即予以0.9%氯化钠注射液灌胃，术后6 h、12 h再次予以0.9%氯化钠注射液灌胃。中药组CLP术后立即予以通腑平喘方（9.9 g/kg）灌胃，术后6 h、12 h再次予以通腑平喘方（9.9 g/kg）灌胃。以上各组均在24 h后麻醉并行腹主动脉采血致死，取出肺组织。

1.4 标本采集与检测

1.4.1 标本采集 用10%水合氯醛 （0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，将腹腔内肠腔等脏器拨开，打开后腹膜，暴露腹主动脉，用10 mL无菌注射器抽取动脉血，1 mL置入肝素化注射器，在室温下行动脉血气分析，其余分装于10 mL无菌试管中，待静置30 min后放入水平离心机中，离心15 min（3 000 r/min），取上层血清，分别装入1.5 mL eppendorf管内，存放在-80℃冰箱待用。大鼠血标本采集完毕后，立即打开大鼠胸腔，小心取出左肺组织，用于肺组织湿干重（W/D）比值测定。取出完整右肺，其中右肺上叶用生理盐水漂洗后，置于10%甲醛中固定，备用于病理及免疫组化检测。右肺中叶及下叶用生理盐水漂洗后分置于eppendorf管内，置入液氮罐中速冻后，于-80℃冰箱保存备用。

1.4.2 各组一般情况观察 CLP术后24 h内观察大鼠的一般情况，如大鼠的活动度、毛发、呼吸、进食饮水、分泌物、排便等情况。

1.4.3 血清MDA、GSH、SOD检测 血清MDA的含量测定采用比色法进行检测；血清GSH的含量测定采用TBA法；血清SOD的含量测定采用WST-8法进行检测，具体步骤完全按照说明书操作。

1.4.4 血清Nrf2及Nrf2 mRNA的含量测定 血清MDA的含量测定采用双抗体夹心法进行检测，具体步骤完全按照说明书操作。Nrf2 mRNA的含量测定采用RT-PCR法测定其表达水平，Real-timePCR反应体系：Rat-GAPDH：NCBI Reference Sequence：NM_017008.4，扩增长度：100 bp。 Sense：5′-GTATGACTCTACCCACG GCA-3′。Antisense：5′-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3′。Rat-Nrf2：NCBI Reference Sequence：NM_031789.2，扩增长度：106 bp。 Sense：5′-AGAAGGAACAGGAGAAG GCC-3′。 Antisense：5′-CCACTGGTGTCTGTCTGGAT-3′。1.4.5 肺组织病理结构观察 将经固定修剪过的右肺组织经脱水后行石蜡包埋，制作成蜡块后于旋转切片机上将肺组织蜡块进行切片（厚度5 μm），涂载玻片后，放置于烘片机上进行烘干。烘干后行肺组织HE染色。

1.4.6 肺组织湿/干质量比 用滤纸沾干左肺组织多余水分后称重（湿质量），后置于60℃烤箱内干烤72 h，再次称重（干质量），计算肺湿/干质量比（W/D）。

1.5 统计学处理

应用SPSS21.0统计软件。计量数据以（x±s）来表示，符合正态分布的数据，并对数据进行方差齐性检验，如果方差齐应用单因素方差分析，如果方差不齐采用秩和检验，以α=0.05作为检验标准。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一情况比较

正常组与假手术组大鼠的活动度、毛发、呼吸、进食饮水、排便情况等均正常。模型组大鼠术后出现活动减少，蜷缩，毛发竖立，呼吸频率加快，不欲进食，腹部膨隆，眼鼻口处可见分泌物，无大便等。中药组大鼠术后一般情况均优于模型组。术后解剖大鼠过程中，假手术组大鼠肺组织的大体外观、颜色等与正常组无差别，而模型组与中药组均可见肺组织不同程度的肿胀、淤点、淤斑。

2.2 各组大鼠肺组织病理切片比较

见图1。正常组及假手术组大鼠肺泡结构完整，腔内清晰，未见炎症细胞机浆液渗出，肺间质未见明显水肿；模型组大鼠肺组织中肺泡结构均被破坏严重，肺泡及间质可见明显水肿，炎症细胞浸润明显，肺毛细血管不同程度出现瘀血及出血改变；中药组大鼠肺组织中亦可见肺水肿及炎症细胞浸润，肺泡结构破坏，肺毛细血管少量的淤血及出血，与模型组相比，肺组织损伤相对较轻。

图1 各组大鼠肺组织病理切片比较（HE染色，100倍）

2.3 各组大鼠肺肺组织W/D值比较

见表1。模型组和中药组的W/D值高于正常组和假手术组（P＜0.01），模型组的W/D值高于中药组（P＜0.01），正常组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠肺肺组织W/D值比较（x±s）

2.4 各组大鼠动脉血氧分压（PaO2）比较

见表2。模型组和中药组的动脉PaO2低于正常组和假手术组（P＜0.01），模型组的动脉氧分压低于中药组（P＜0.01），正常组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠动脉血 PaO2比较（mmHg，x±s）

2.5 各组大鼠血清MDA、SOD、GSH水平比较

见表3。模型组大鼠血清MDA含量与正常组、假手术组及中药组相比明显升高（P＜0.01），中药组与模型组相比，大鼠血清MDA含量明显下降（P＜0.01）。中药组与正常组及假手术组差异无统计学意义 （P＞0.05）。模型组和中药组的血清SOD、GSH含量低于正常组和假手术组（P＜0.01），模型组的血清 SOD、GSH含量低于中药组（P＜0.01），正常组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清MDA、SOD、GSH水平比较（x±s）

2.6 各组大鼠血清Nrf2、Nrf2 mRNA比较

见表4。模型组和中药组的血清Nrf2含量高于正常组和假手术组（P＜0.01），中药组的血清Nrf2含量高于模型组（P＜0.01），正常组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组和中药组的Nrf2 mRNA表达水平高于正常组和假手术 （P＜0.01），中药组的Nrf2 mRNA表达水平高于模型组（P＜0.01），正常组与假手术组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠血清Nrf2、Nrf2 mRNA比较（x±s）

3 讨 论

通腑平喘方是上海中医药大学附属曙光医院急诊科常用中药制剂，方中大黄、芒硝及桃仁三者共为君药，功可泻热攻下通里、釜底抽薪、通腑存阴。桑白皮性味甘、寒，归肺经，能泻肺平喘、利水消肿。桑白皮汤治疗脓毒症呼吸衰竭（痰热壅肺证）临床观察中发现桑白皮汤能提高患者氧合指数，降低急性生理与慢性健康情况评价Ⅱ（APACHEⅡ）评分，显著改善患者的临床症状［4］。葶苈子性味苦、辛、大寒，归肺经及膀胱经，其具有泻肺平喘、利水消肿的功效，而且专泻肺中痰火及痰饮而平喘。其与桑白皮相须为用，增强泻肺平喘之功，三者共为臣药，三者共用可泻肺平喘，清热化痰止咳，与君药相配，增强通腑泻热平咳喘之功效，也体现了“肺肠同治”的理论。加上活血通便的当归，凉血解毒、滋阴降火的赤芍与玄参同为佐药；全方主以通腑泻热，辅以化痰平喘，同时加以活血清营，配伍恰当。前期研究表明通过通腑泻热能改善脓毒症ALI/ARDS患者喘促、憋闷、腹胀便秘等临床症状，提高患者的氧合指数，缩短机械通气治疗，降低病死率［5］。

在脓毒症的发病机制中，氧化应激反应与脓毒症及脓毒症ALI密切相关，是重要的发病机制之一。ALI是由创伤、烧伤和脓毒症等应激状态下引起的急性并发症［6-8］，目前研究表明氧化应激在 ALI中起重要作用［9-10］。在正常生理状态下，体内的氧化系统与抗氧化系统处于平衡状态，当机体遭受各种有害的刺激时发生氧化应激，体内产生过多的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS），机体无法清除而导致组织损伤［11］。 Nrf2是与氧化应激密切相关的核转录因子，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）是一种肌动蛋白结合蛋白，其上的半胱氨酸残基非常敏感，常常被看作是一个氧化应激感受器。在正常生理状态下，细胞质中的Nrf2与Keap1相结合处于稳定状态，当氧化应激发生后，Nrf2与Keap1解离进入细胞核，Nrf2与抗氧化物反应原件（ARE）相互作用，调控下游的抗氧化蛋白表达，具有抗氧化应激、抗炎与抑制调节细胞凋亡等功能［12］，在细胞的防御与保护中起着重要作用。在抗氧化的信号通路中，Keap1-Nrf2/ARE 是重要的信号通路［13-14］。

MDA是生物膜上不饱和脂肪酸受活性氧攻击而发生脂质过氧化后的产物。机体脂质过氧化的程度及自由基水平通过它的含量来衡量［15］。SOD是在氧化应激反应中帮助机体清除氧自由基的一种重要的酶，是体内重要的氧自由基清除剂，在生物体内氧自由基清除系统中的一道重要防线。GSH是一种小分子三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，它是体内重要的抗氧化剂，在机体抗氧化损伤中起着重要的作用。Ji等用碳酰氯建立ALI模型研究中证实了Nrf2表达水平的升高，Nrf2在核内积聚，GSH的表达水平上升从而降低碳酰氯对小鼠的氧化应激损伤［16］。赵京禹等实验研究发现ALI大鼠组中发生显著的氧化应激反应，其MDA和髓过氧化物酶 （MPO）的水平显著升高，SOD的水平显著下降［17］。袁鼎山等在实验研究中发现GSH干预组与假手术组中的PaO2和GSH含量均高于模型组，而且GSH干预组的肺损伤较模型组明显减轻［18］。

本研究中药组与正常组、假手术及模型组相比，血清Nrf2含量及肺组织中Nrf2 mRNA显著升高，SOD和GSH也显著升高，说明通腑平喘方可以上调Nrf2，启动ARE从而促使SOD和GSH的表达量增加，发挥抗氧化作用，从而防止组织损伤，而且中药组中的血清MDA含量显著低于模型组，中药组中PaO2含量显著高于模型组。本研究表明通腑平喘方能减轻大鼠肺水肿、肺病理损伤程度，上调肺组织Nrf2 mRNA表达及血清中Nrf2含量，启动ARE相关抗氧化蛋白SOD、GSH，从而抑制氧化应激反应，改善氧合功能，对脓毒症大鼠肺组织具有保护作用，起到抗氧化应激的作用。可见，抗氧化治疗可以为以后临床治疗脓毒症提供新的思路与方向。