云南春燥证动物模型建立过程中的问题及思考

魏宁颐,何 丹,林 丽,王雪梅,林银骥,杨 梅

(云南中医学院,云南 昆明650500)

1 实验动物

现国内外可以作为实验用的动物有百余种,大致可以分为三类：哺乳类、鸟类、两栖类。鸟类动物在实验中因场地及个体生存因素要求较多,未被采用。两栖类如青蛙多用于实验教学,本课题也暂不考虑。另外,考虑实验动物当与人体生理、病理相似,故课题组拟从哺乳类中选择实验动物。哺乳类实验动物常用的有：兔、猴、狗、大鼠、小鼠等。家兔对温度变化表现明显；犬猫科动物对喂养食物敏感,容易发生呕吐反应；猴进化程度与人类最为相似,为理想的实验动物,但其饲养成本高,课题组经费有限最终也未选择。大鼠多用于安全性试验及生长发育相关的研究,对呼吸道疾病有较强的抵抗力,为更好地观察云南春燥证引起的呼吸道病理改变,也未选用。小鼠形体小、饲养空间成本要求低,且对温差敏感,2～3℃就能引起生理上的改变,符合中医动物模型必须充分体现中医的基本特点并结合辨证论治等思路[4-5],且有文献表示小鼠可以用于解热镇静研究[6]。现我国实验小鼠种类繁多,经过科研工作者的多年选育,昆明种小鼠适应力强,成活率高,饲养成本低,我国有70%的中医证候实验采用昆明种小鼠,具有丰富的实验基础。最终课题组结合实验需要及相关实验指标的要求选取昆明种小鼠作为实验用鼠。

2 制模因素

中医证候动物模型的制作方法有模拟病因、复制症状、药物反证等方法,本研究采用模拟病因的方法来制作云南春燥证动物模型。

中医学用阴阳来概括自然界和人体,阴在内,阳在外,阴阳失调可以为致病因素。云南春燥证形成的原因也可以从内外2个因素考虑。在外为云南地区春季特有的气候因素：多风、少雨、土质稀薄不易存水、1000多米的海拔紫外线强度较高；在内为云南人嗜食辛辣的饮食特征。考虑以上2种重要原因,造模选择在特殊制定的人工气候箱进行,课题组借鉴西北燥证造模经验,及外燥证小鼠造模经验,在了解云南地区春季平均气温后,最终将云南春燥模型造模外因因素定为温度(23±2)℃,相对湿度(31.5±2)%,每日am10∶00-pm8∶00打开风扇,风速2.7m/s进行吹风,同时给予正常光照。课题组自配小鼠可用的香燥饲料配方如下,辣椒粉∶五香粉=1∶3,饲料∶香燥配料=100∶1(五香粉为云南昆明华瑞食品加工有限公司生产),从而模拟云南春燥的致病内因。

3 实验指标

云南春燥证临床常以口鼻、咽喉、肌肤干燥和干咳为临床特征[3]。故实验在初步设计指标时拟选取三个基本指标,意在验证造模方法的可行性及效果。小鼠生物表征(活动度、饮食、二便、毛发),腹背皮肤含水率,气道sIg A、SP-A以及SP-D,小鼠腹部、背部肌肤的含水率,以测量春燥环境对小鼠皮肤干燥程度的影响。

实验过程中课题组对小鼠生物表征进了观察,目前得到一些表征的变化[7-8],例如实验小鼠出现烦躁、易怒、可见实验小鼠身上打斗后的咬痕；小鼠毛发稀疏,缺少光泽；爪甲颜色变暗等。欲提高实验准确度,建议实验后期对这些生物指标进行定量分析,制定定性分析表,采用更多的实验手法验证小鼠生物表征、生活习性等,而非只是目前的定性分析,让实验更具定量意义。实验初期,因动物颈部猝死后摘取肺组织进行病理检测,故腹部皮肤采样面积过小,无法进行含水率的测量,建议后期实验中注意再杀小鼠方式,尽量保证小鼠腹部皮肤完整性,以便于进一步测量腹部皮肤含水率。

4 模型标准

课题组造模采取的是病因造模法,在判断模型是否成功因素上,参考云南春燥证临床症状,效仿丁建中[9]、杨静宁等人[10]应用桑杏汤、沙参麦冬汤分别检测温燥及阴虚内燥的方法,验证云南春燥动物模型。初步筛选部分指标进行论证,例如：小鼠皮肤含水率降低、小鼠二便干燥、小鼠呼吸道出现因干燥引起的一系列病理性反应,如气道免疫球蛋白、呼吸道组织变化、大肠组织变化、呼吸道纤毛运动等。同时对造模小鼠给予桑杏汤治疗,实验结果表明,桑杏汤组小鼠情志、体重、饮食量、饮水、毛发、二便等均有改善,气道sIg A、SP-A以及SP-D含量均明显下降。结果提示桑杏汤干预下的云南春燥证小鼠模型临床症状有所改善,可以说明云南春燥受外燥影响明显[11]。

5 存在的问题

当前阶段课题组依据文献及相关类似实验经验采用病因造模法,探讨稳定并可以复制的云南春燥证造模方法。在造模2周后检测了部分实验指标,包括生物表征、皮肤含水量、气道免疫球蛋白等,实验结果所示[6-7]小鼠经过2周的人工气候箱饲养,已经开始出现生物表征的变化,这种变化随着饲养在干燥气候的时间增加而越来越明显；小鼠的肺组织及气道内sIg A、Sp-A含量下降,SP-D、IgG含量上升。因实验处在起步阶段,当前实验指标过少,无法准确判断造模是否成功。课题组应当进一步扩大实验指标检测范围,筛选云南春燥证黄金指标,例如代表肺津的水通道蛋白、免疫应答白介素细胞、呼吸道黏膜运动情况等指标。同时,在现阶段已出现变化的实验指标上,进一步采取以方测证法、反证动物模型,进一步完善云南春燥动物模型的科学性。

6 结语

本课题组云南春燥证动物模型的研制已开展一段时间,目前课题组已初步完成模型的建立,并检验了小鼠生物表征(活动度、饮食、二便、毛发),背皮肤含水率,气道sIg A、SP-A以及SP-D这些指标,从目前实验数据来看,云南春燥动物模型的建立已取得阶段性成果。但为确保实验的严谨性、科学性,建议课题后期重点筛选更多实验指标,规范实验客观指标,尽可能应用可量化实验指标。同时进一步确定云南春燥证动物模型的黄金指标,并对已出现变化的实验指标进行“以方测证”,运用反证方法对动物模型进行检测,建立科学的可复制的云南春燥动物模型。