新城疫病毒抗恶性肿瘤研究进展

徐婷婷，韩继武

(哈尔滨医科大学附属第四医院消化科，哈尔滨 150001)

肿瘤是威胁人类生命健康的难治疾病，肿瘤细胞利用自身的高突变性逃避免疫监视，抑制免疫反应[1]；同时，肿瘤细胞可进行无限复制、转移、侵袭组织，最终导致器官衰竭甚至死亡。虽然现有的治疗方法在不断改善，并出现了新的创新疗法，但新病例数每年都在增加[2]。通过避免暴露于常见的危险因素，如烟草、烟雾、酒精和核辐射等，可以预防一部分肿瘤的发生；此外，通过手术、放疗、化疗、激素和单克隆抗体治疗可以治愈一部分肿瘤，特别是一些发现较早的肿瘤。但这些针对肿瘤患者的治疗方法常在治疗后出现严重不良反应。理想的肿瘤治疗剂是可以选择性地杀死恶性细胞，同时对正常细胞和组织没有副作用。溶瘤病毒疗法是指通过选取自然界中存在的一些致病力较弱的病毒株或通过对某些病毒进行有目的性的基因改造而形成的具有靶向及杀伤肿瘤细胞功能的病毒来治疗肿瘤的一种新方法[3]。其中，新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)可以特异地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有伤害，是安全、有效的溶瘤试剂[4]。NDV本身的高靶向性及分子生物技术的成熟使其在癌症治疗中的应用研究越来越深入。现就NDV抗恶性肿瘤研究进展予以综述。

1 NDV的肿瘤选择性

NDV是一种有包膜、非节段的负链RNA病毒，为副黏病毒亚科的禽副黏病毒属，共编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和大聚合酶蛋白。核衣壳蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白形成核糖核蛋白复合物，负责病毒的转录和复制[5]；血凝素-神经氨酸酶蛋白和融合蛋白作为表面糖蛋白锚定在病毒包膜中，其中血凝素-神经氨酸酶蛋白负责病毒与宿主细胞受体的连接，融合蛋白负责宿主细胞膜与病毒包膜相融合[6]。

所有RNA病毒的复制生命周期均涉及双链RNA的形成，该双链RNA结构激活基于Ⅰ型干扰素的重要细胞防御系统(α干扰素和β干扰素细胞防御系统)发挥清除病毒的作用。突变的肿瘤细胞通常会使干扰素系统瘫痪，使防御系统细胞增殖受到抑制，清除病毒能力下降[7]。故突变的肿瘤细胞允许NDV在其自身肿瘤细胞中大量复制。NDV的肿瘤选择性机制可概括为：抗病毒信号转导途径激活的缺陷、Ⅰ型干扰素信号通路的缺陷[8]。

NDV对细胞的感染包括两个步骤：①细胞结合、膜融合、病毒基因组的转导和转录。②使用新生成的核衣壳作为基因组进行病毒复制。NDV感染人或小鼠的正常细胞通常不会进入第二步，但在几乎所有测试的人或小鼠肿瘤细胞中，NDV感染均进行到第二步，允许肿瘤选择性复制[9]。与大多数人类正常细胞相比，NDV在人类肿瘤细胞中的复制速度增加了10 000倍。

2 NDV的抗肿瘤作用机制

2.1诱导肿瘤细胞凋亡 研究表明，NDV能够通过触发内在线粒体途径和外在死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡[10]。在线粒体途径中，NDV感染在降低肿瘤细胞线粒体膜电位的同时释放细胞色素C和其他膜间隙蛋白，激活下游胱天蛋白酶9，产生凋亡小体并激活下游胱天蛋白酶3，从而引起肿瘤细胞凋亡。已检测到NDV血凝素-神经氨酸酶蛋白诱导被感染肿瘤细胞释放肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，并与其相应死亡受体结合形成死亡受体复合物，通过Fas相关蛋白和死亡结构域的中间衔接蛋白激活胱天蛋白酶8。内在线粒体途径和外在死亡受体途径最终将促进机体启动胱天蛋白酶级联反应，而胱天蛋白酶通过裂解核蛋白及相关细胞器来造成肿瘤细胞凋亡[11]。迄今为止，NDV介导肿瘤细胞凋亡所产生的溶瘤效果已在乳腺癌[12]、宫颈癌[13]、结直肠癌[14]等恶性肿瘤中被证实。

2.2诱导肿瘤细胞自噬性死亡 自噬是一种分解代谢且高度保守的细胞过程。它的基本作用是在营养饥饿和其他压力条件下回收细胞成分，并被认为是细胞保护事件[15]。对于NDV，只有少数研究探索病毒感染期间自噬的诱导和影响。而自噬似乎是NDV介导肿瘤细胞死亡反应的重要组成部分，并在感染早期触发。NDV感染肿瘤细胞的早期阶段产生的自噬反应能够防止肿瘤细胞的过早消除，有益于病毒自身的复制和存活，并在感染后期诱导肿瘤细胞死亡。Meng等[16]研究发现，NDV可触发人神经胶质瘤中自噬体的形成，表现为胶质瘤细胞在感染病毒后显示完全自噬通量、自噬蛋白早期的增加和持续存在以及自噬底物p62的逐渐减少。且使用自噬正调节剂雷帕霉素病毒的产量增加，使用自噬抑制剂氯喹病毒的产量减少。有研究表明，敲除自噬相关基因可导致NDV复制产量减少[17]，再次证明自噬有益于细胞中NDV的复制。为阐明早期阶段自噬能够抑制肿瘤细胞的过早清除，Meng等[18]研究了人非小细胞肺癌A549细胞对NDV感染的反应。他们观察到，感染细胞中p62依赖性线粒体自噬过程的诱导，导致NDV感染时受损线粒体的消除、细胞色素C释放减少，从而抑制肿瘤细胞过早消除。

2.3诱导抗肿瘤免疫 免疫原性细胞死亡是细胞死亡的重要形式，其能诱导强效抗肿瘤免疫的危险相关分子模式(钙网蛋白、热激蛋白、高迁移率族蛋白1等)的释放[19]。这些关键危险相关分子模式不仅可以激活一些先天免疫细胞(自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞)，还可以活化肿瘤特异性T细胞，同时将抗原呈递细胞吸引到肿瘤组织来启动免疫应答。与传统免疫原性细胞死亡诱导剂一样，溶瘤病毒亦是很有潜力的免疫原性细胞死亡诱导剂[20]。Ye等[21]的研究显示，溶瘤性NDV能在体外触发人肺癌细胞免疫原性细胞死亡并使钙网蛋白暴露、高迁移率族蛋白1和热激蛋白释放，而来自NDV感染肺癌细胞的上清液在异种移植物模型中能减少肿瘤的形成，表明NDV诱导肺癌细胞死亡具有免疫原性，并与主要免疫原性细胞死亡决定簇(钙网蛋白、高迁移率族蛋白1、热激蛋白)的释放有关。同时，肺癌细胞中自噬相关基因的消耗显著抑制了NDV对免疫原性细胞死亡决定簇的诱导，证明自噬在NDV诱导的免疫原性细胞死亡中起一定作用。在原位小鼠神经胶质瘤模型中，NDV不仅能诱导钙网蛋白、热激蛋白和高迁移率族蛋白1释放，还能诱导肿瘤特异性免疫T细胞记忆[22]。

NDV除了能诱导免疫原性细胞死亡释放危险相关分子模式改变免疫抑制性肿瘤微环境外，其病原体相关分子模式(双链RNA、血凝素-神经氨酸酶蛋白等)还可以被先天免疫细胞的相关模式识别受体识别，启动多种反应途径，最终诱导促炎细胞因子的释放和免疫细胞的激活[9]。此外，NDV感染还可以打破机体肿瘤细胞对免疫疗法的抵抗。研究证明，人类T细胞对黑素瘤的耐受性能被NDV的感染破坏；同时在小鼠黑色素瘤模型中，局部溶瘤性NDV疗法被证明可以克服对免疫检查点阻断免疫疗法的系统性肿瘤抗性[23]。这为临床研究免疫检查点阻断剂与溶瘤性NDV联合治疗提供了强有力的理论依据。

3 NDV为载体的抗肿瘤治疗作用

虽然NDV是肿瘤治疗的理想候选者，但其溶瘤效果仍需提高。近年来，反向遗传学技术提供了一种可用于研究和开发具有更强溶瘤能力的NDV方法。该技术是在体外将NDV基因组RNA逆转录成互补DNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作(外源基因的插入)，再将NDV基因组的互补DNA转染适当细胞以获得重组NDV(recombinant newcastle disease virus，rNDV)。现已应用该技术构建了许多表达外源基因的rNDV[24-27]，其与亲本病毒相比表现出更强的肿瘤治疗效果。

3.2增强对肿瘤细胞的凋亡作用 肿瘤抑制因子是一种应激激活转录因子，可调节多种基因的功能，包括DNA修复、细胞凋亡、细胞周期停滞、代谢和衰老。在大约50%的人类肿瘤中，肿瘤抑制因子发生基因突变并丧失其功能，故恢复肿瘤抑制因子的活性来预防肿瘤形成或导致肿瘤消退是一种潜在治疗方法[37]。p53作为转录因子可以调节多种蛋白质的功能，如促凋亡蛋白、胱天蛋白酶、死亡受体等[38]。表达p53基因的rNDV能使肝癌细胞的线粒体膜电位降低，这是肿瘤细胞开始凋亡的关键步骤[39]。同时，其还能使胶质瘤细胞中p53下游蛋白p21和胱天蛋白酶3的转录活性显著上调，并显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bim和Bax的表达[40]，表明p53基因的插入提高了NDV诱导肿瘤细胞凋亡的能力。为补充和增加NDV的促凋亡能力，Cuadrado-Castano等[41]构建了编码人肿瘤坏死因子受体Fas的rNDV，感染期间Fas受体的过表达可促进外源性凋亡途径的上调和细胞死亡水平的升高。与亲本NDV相比，用表达肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体的rNDV处理小鼠的肿瘤组织中可见肿瘤细胞排列松散、肿瘤细胞体积减小、肿瘤细胞出现核固缩及更多坏死病灶[42]。可见，使用NDV为载体递送外源治疗基因可以显著增强促肿瘤细胞凋亡作用，是治疗肿瘤的理想方法。

4 小 结

恶性肿瘤是全球人类死亡的常见原因，但目前的治疗方法并未大大提高患者的生存率，尤其是转移瘤。插入外源治疗基因的rNDV代表一类新的具有增强NDV治疗效果的独特生物制剂，其优势在于：①rNDV维持了亲本病毒的安全性；②rNDV可以稳定表达外源治疗基因的功能；③rNDV仍然保留亲本病毒的肿瘤杀伤能力，且能够增强宿主抗肿瘤免疫应答。但其抗肿瘤的效果有待进一步研究。未来，可探索NDV的外源基因最佳插入位点，使外源治疗基因达到最高表达水平，且对NDV复制影响最小；同时，也可探索最佳注射时间和注射次数以优化治疗效果。