人卵母细胞冷冻研究进展

杨金姬，李红义

(武装警察部队特色医学中心军人生殖医学科，天津 100162)

卵母细胞冷冻是辅助生殖的关键技术之一。卵母细胞具有体积大、表面积与体积比小、含水量高和存在减数分裂纺锤体等特点，故成熟卵母细胞是最难成功冷冻的细胞之一。与精子和胚胎冷冻相比，卵母细胞冷冻保存技术的发展较缓慢。1986年，Chen[1]首次报道，采用慢速冷冻技术将人卵母细胞进行低温保存，解冻时将冷冻管浸入37 ℃水浴中进行快速复温，随后进行体外受精和胚胎移植术，成功获得双胎妊娠。卵胞质内单精子显微注射技术可有效解决卵母细胞冷冻过程中因卵母细胞皮质颗粒过早释放造成的透明带硬化，并可避免冷冻过程对受精率的影响[2]。1997年，Porcu等[3]利用卵胞质内单精子显微注射作为人冷冻卵母细胞的体外受精方式，成功获得妊娠并出生1名健康女婴。20世纪八九十年代，人卵母细胞冷冻的研究取得了较大进展，但卵母细胞复苏存活率仍较低，玻璃化冷冻技术的出现较大程度上提高了卵母细胞的复苏存活率。1999年，Kuleshova等[4]对1名47岁女性成功实施了玻璃化冷冻卵子胚胎移植，使其成功妊娠并获得1名健康女婴。此后，多项研究证实，与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻技术可使冷冻卵母细胞获得更高的存活率和妊娠率[5-7]。2004年，意大利立法禁止进行胚胎冷冻，此措施加速了卵母细胞冷冻技术的发展[8]。2013年美国生殖医学协会和辅助生殖技术协会执业委员会指出，卵母细胞冷冻-复苏不应再被认为是实验性的[9]。卵母细胞冷冻技术的日趋成熟为医学或非医学原因希望保持生育能力的女性提供了一个新的选择。但由于卵母细胞本身特殊结构以及冷冻技术的差异，与新鲜卵母细胞相比，冷冻卵母细胞的临床结局尚未达到令人满意的效果。现对人卵母细胞冷冻的研究进展予以综述。

1 卵母细胞冷冻的应用

胚胎冷冻保存是一种非常稳定的现有生育力保存技术，广泛应用于体外受精治疗，但对于无男性伴侣或不愿使用供精者精子获得胚胎的女性而言，则无法通过胚胎冷冻实现生育力保存，母细胞冷冻技术可为这部分有生育力保存愿望的女性提供新的选择。

目前，卵母细胞冷冻主要应用于：①面临放疗和化疗的肿瘤患者以及需要预防性切除卵巢的遗传性疾病患者，卵母细胞冷冻保存使患者疾病治愈后仍有生育可能[10]；②辅助生殖治疗的需要：取卵当日男方无法提供足够精子，可将女方卵母细胞冷冻储存[11]；③受法律、宗教、伦理的限制而无法进行胚胎冷冻的人群[8]；④因社会因素需要延迟生育的女性，卵母细胞冷冻储存可为其需要生育时提供帮助[12]；⑤卵巢低反应女性可通过卵母细胞冷冻技术累积卵子。

我国《人类辅助生殖技术规范》中规定：禁止单身妇女实施人类辅助生殖技术，因此目前我国卵母细胞冷冻技术主要应用于辅助生殖治疗过程，单身女性尚不能通过卵母细胞冷冻保存生育力[13]。

2 影响卵母细胞冷冻临床结局的因素

2.1卵母细胞冷冻方法 目前，人卵母细胞冷冻主要有慢速冷冻和玻璃化冷冻两种。慢速冷冻也称程序化冷冻，将卵母细胞在缓冲液中短暂平衡数秒后放入含渗透性冷冻保护剂中初步脱水10 min，随后将卵母细胞移至含渗透性和非渗透性冷冻保护剂中进一步脱水5 min，最后将其装入冷冻载体并放入程序冷冻仪；程序化冷冻的降温速度为0.2～2.0 ℃/min，缓慢降温使细胞充分脱水，温度降至-5～-7 ℃时，行人工植冰并继续慢速降温至-80 ℃左右，最后将冷冻麦管置于液氮中保存[14]。

早期关于成功卵母细胞冷冻的报道均采用慢速冷冻技术。慢速冷冻所用的冷冻保护剂的浓度相对较低，对卵母细胞的毒性较低，但降温速度慢，冷冻时间较长，冷冻和复苏过程中易形成冰晶，导致卵母细胞损伤，此外，慢速冷冻所需冷冻设备价格昂贵，冷冻过程对设备以及相关保障措施的要求较高。

玻璃化冷冻是将在较低浓度冷冻保护剂中平衡5～10 min后的卵母细胞转入更高浓度冷冻保护剂中再平衡1 min，随后将含有卵母细胞的微量冷冻保护液滴装入冷冻载体直接投入液氮中进行保存直至使用。玻璃化冷冻利用更高浓度冷冻保护剂使卵母细胞充分脱水，通过快速降温(降温速率可达20 000 ℃/min)可使细胞内外液体均达到玻璃化状态，但不会形成冰晶。与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻液的浓度更高，高浓度的冷冻保护剂可能对卵母细胞产生毒性影响，为了降低其毒性，通常采用浓度逐渐升高的冷冻液使卵母细胞逐步脱水[14]。玻璃化冷冻的操作步骤相对简单，但需要在较短时间内完成精细操作，对操作人员的技术要求较高，操作的熟练程度将直接影响卵母细胞存活率。

1999年，人卵母细胞玻璃化冷冻首次获得成功，标志着卵母细胞冷冻研究取得了突破性进展[4]。据报道，玻璃化冷冻卵母细胞解冻存活率达90%～97%，体外受精率达71%～79%，移植率为17%～41%，每次移植的临床妊娠率为 36%～61%[9]。近年来，多项研究表明，与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻的卵母细胞存活率、临床妊娠率和活产率均更高[15-17]。目前玻璃化冷冻已经逐步取代慢速冷冻成为人卵母细胞冷冻的首选方法[18]。以意大利为例，2007年，玻璃化冷冻卵母细胞仅占17.8%，慢速冷冻占82.2%，而2013年，慢速冷冻卵母细胞仅占14.4%，玻璃化冷冻卵母细胞占85.6%[19]。有学者建议，仍使用慢速冷冻的实验室，应该考虑改用玻璃化冷冻技术进行卵母细胞冷冻[7]。

2.2女性年龄 女性年龄是影响卵母细胞冷冻临床结局的重要因素[20-21]。无论采用何种冷冻方法，冷冻卵母细胞的临床妊娠率和活产率均随女性年龄的增长而降低[22-23]。一项回顾性研究显示，35岁及35岁以下女性卵母细胞冷冻活产率为50%，而35岁以上女性卵母细胞冷冻活产率仅为23%；与35岁以上女性相比，35岁及35岁以下女性的累计活产率更高，并随冷冻卵母细胞数量的增加，其累计活产率增长速度更快，当冷冻5枚卵母细胞时，35岁及35岁以下女性的累计活产率为15.4%，当冷冻8枚卵母细胞时，35岁及35岁以下女性的累计活产率可升至40.8%，由此可见，每增加1枚卵母细胞，35岁及35岁以下女性的累计活产率可升高8.4%，而35岁以上女性的累计活产率仅从冷冻5枚卵母细胞的5.1%升至冷冻8枚卵母细胞的19.9%。当冷冻卵母细胞为10～15枚时，35岁及35岁以下女性的累计活产率可达60.5%～85.2%，而35岁以上女性卵母细胞数增至11枚以上时，累计活产率为35.6%[21]。

目前，对有效冷冻保存卵母细胞的最佳年龄尚不清楚。随着年龄的增长，女性获卵数不断减少，非整倍体卵母细胞数量不断增加，故建议计划保存生育力女性在30～35岁行卵母细胞冷冻，即在女性自然生育能力下降之前行卵母细胞冷冻[18]。

2.3卵母细胞冷冻载体 高效的卵母细胞存活率是保证卵母细胞冷冻成功的首要条件，极高的冷却和升温速率是卵母细胞冷冻的关键技术环节，故冷冻载体的选择极其重要。目前，大多数中心使用的卵母细胞冷冻载体为改良的吸管、毛细管和尼龙环等，此类载体一般由塑料薄膜连接到杆上，冷冻时将样本微滴放置于薄膜片末端，将其直接浸入液氮，再使用管状封套封闭装载样本的另一端，可在一定程度上保护样本，但冷冻样本仍与液氮长期直接接触，故称为“开放系统”。开放式载体的冷却速率(>20 000 ℃/min)极高，使卵母细胞的存活率较高，但卵母细胞直接暴露于未经消毒的液氮中，存在交叉污染的风险[15]。目前尚未有开放式载体相关传染性疾病扩散的报道，但污染风险可随卵母细胞存储时间的延长而增加。为了避免交叉污染，另一种“封闭系统”应运而生。封闭式载体在样品和液氮之间提供了一个物理屏障，在理论上提高了生物安全性。但与开放式载体相比，封闭式载体的冷却/复温速率相对较慢，冷冻效果不佳[24]。另有学者认为，玻璃化冷冻卵母细胞的存活率主要受复温速率的影响，提高封闭式载体的复温速率也可获得较好的冷冻效果[25-26]。

开放式和封闭式载体各有优缺点，有关最适合卵母细胞冷冻的载体形式目前尚无定论。有学者建议通过以下3种方法降低卵母细胞冷冻储存过程中可能发生污染的风险：①使用经紫外线消毒的液氮；②储存于液氮的气相中，液氮气相中环境空气污染物的浓度较低；③使用无菌空气[27]。

2.4卵母细胞成熟度 GV期、MⅠ期卵母细胞为不成熟卵母细胞，MⅡ期卵母细胞为成熟卵母细胞，目前文献报道的成功案例绝大多数为MⅡ期的成熟卵母细胞，而未成熟卵母细胞冷冻成功妊娠的报道较少[28-29]。未成熟卵母细胞易获得且数量多，其细胞染色体仍处于核内，尚未形成易受冷冻损伤的纺锤体，且未成熟卵母细胞的胞膜通透性可能优于MⅡ期卵母细胞，因此理论上未成熟卵母细胞冷冻更具优势。但目前未成熟卵母细胞体外成熟培养技术尚不成熟，未成熟卵母细胞解冻后体外培养的成熟率、受精率及妊娠率均较低，多数研究认为，将GV和MⅠ期未成熟卵母细胞在体外成熟培养后，再行玻璃化冷冻的效果可能更好[30-31]。

2.5卵母细胞冷冻保存时间 目前，关于人卵母细胞冷冻保存时限尚无定论，Urquiza等[32]采用慢速冷冻技术保存了1名24岁不孕患者的6枚成熟卵母细胞，14.5年后经患者要求将卵母细胞解冻，其中只有2枚卵母细胞存活，卵胞质内单精子显微注射后只有1枚卵母细胞正常受精，胚胎移植后成功获得妊娠，并足月分娩1名健康女婴，这是目前报道的储存时间最长并获得活产的案例。

卵母细胞玻璃化冷冻的应用相对较晚，储存时间对其临床结局影响的报告尚不多。一项大型回顾性研究显示，超过4.2万个卵母细胞在玻璃化冷冻6个月以内、6～12个月、12～18个月、18～24个月、24～36个月、36～48个月, 48～60个月、60个月以上8种不同储存时长的存活率、临床妊娠率和持续妊娠率的差异无统计学意义[33]。有数据显示，卵母细胞较长时间的冷冻保存似乎不会对临床结局产生不利影响，但卵母细胞在液氮罐中长期储存却存在一定风险[34]。因此，每个中心都应该安装储罐报警系统，并制定应急计划，以应对储罐破裂等突发事件，减少储存材料损失。

3 卵母细胞冷冻损伤

由于卵母细胞体积大、含水量高以及其特殊的细胞内含物和结构，其对低温特别敏感，易发生冷冻损伤。温度骤降会导致卵母细胞的温度敏感结构发生冷休克，影响其功能，如改变膜的通透性或破坏细胞内的细胞器[35]。有研究证实,不管是采用何种冷冻技术，冷冻卵母细胞2/3的皮质颗粒均发生释放，皮质颗粒非生理性释放导致卵母细胞透明带过早硬化，影响正常受精[36-37]。为避免冷冻卵母细胞受精失败，可选择胞质内单精子注射作为冷冻卵母细胞的体外授精方式。此外，减数分裂纺锤体对温度也极其敏感，即使卵母细胞在室温下短暂暴露，也会造成纺锤体结构的不可逆破坏，当温度降到0 ℃时，则发生快速去极化[38]。在冷冻过程中，将卵母细胞暴露于冷冻保护剂中，纺锤体的结构可能保留下来，但在解冻过程中纺锤体的结构完全丧失[39-40]。进一步研究证实，低温保存纺锤体可使其恢复重新组装的能力[41]。纺锤体微管的重新组装是受精后染色体正确排列和分离的必要条件。卵母细胞减数分裂纺锤体的破坏可能导致非整倍体胚胎发生，但这一假说尚未得到证实。有研究显示，慢速冷冻和玻璃化冷冻技术处理的冷冻卵母细胞胚胎中均未观察到非整倍体率的增加[42]。降低卵母细胞冷冻损伤以及提高卵母细胞冷冻的安全性是目前卵母细胞冷冻研究的热点之一。

4 冷冻卵母细胞子代的安全性

与其他辅助生殖技术一样，冷冻卵母细胞子代的安全性亦非常重要。Noyes等[43]对1986—2008年936名卵母细胞冷冻出生婴儿(包括慢速和玻璃化)资料的回顾分析发现，1.3%(12/936)存在出生异常，与同期自然受孕分娩婴儿相比，两者出生缺陷率无明显差异。Cobo等[44]比较玻璃化冷冻卵母细胞出生的804名婴儿与新鲜卵母细胞出生的996名婴儿相关数据的研究发现，两者的孕期并发症、出生体重、Apgar评分、新生儿出生缺陷、重症监护室住院率及病死率的差异均无统计学意义，Levi-Setti等[19]的大样本研究结果与此类似。已有证据表明，卵母细胞冷冻保存与产科和围生期并发症的增加无关，但尚缺乏长期随访研究的支持，临床应用仍需谨慎。

5 结 语

20世纪80年代，人卵母细胞冷冻取得了第一次成功，随后，玻璃化冷冻技术的出现大大改善了人卵母细胞冷冻的临床结局。目前，卵母细胞冷冻已成为保存女性生育力的重要方法，并已广泛应用于临床，但由于卵母细胞本身特殊结构和冷冻技术的差异，卵母细胞冷冻的临床结局仍未获得令人满意的一致结果。冷冻技术的标准化和(或)自动化是未来卵母细胞冷冻技术的研究重点，期待相关研究取得更大进展，以提高卵母细胞冷冻的一致性及效率。