VEGF-A和VEGFR-2基因多态性对婴幼儿血管瘤患病风险的影响

李 蕾，梁 巍，陈 琛，张红鹏

(1.河北省人民医院 a.小儿外科,b.病理科，石家庄 050000； 2.邯郸市第七医院普外科，河北 邯郸 056000)

血管瘤是婴幼儿时期常见的良性肿瘤之一，好发于头、面、颈、会阴等重要部位，部分患儿病变范围广[1-2]。大部分血管瘤病变可随患儿生长发育自行消退，且病变消退过程对患儿生命健康无危害，但部分大面积血管瘤完全消退后会出现患处皮肤松软下垂、色素改变、浅表瘢痕等，对患儿及其家长心理产生一定的负面影响，不利于患儿早期的身心健康[3]。血管瘤常出现于患儿出生时或出生后数天至数周，早期出现内皮细胞的迅速恶性增殖，表现为逐渐突出于皮肤表面的红色斑块及皮下青紫色包块，随着患儿的生长发育可发生自发消退，具有一定的自限性[4]。血管瘤的治疗方式多种多样，在血管瘤药物治疗中，最常用的治疗药物为普萘洛尔，疗效较确切，但可出现一定的不良反应，长期服用可出现心率减慢、心律失常、低血压、低血糖、支气管痉挛等严重并发症[5]。研究指出，普萘洛尔的规范治疗可明显缩短婴幼儿血管瘤的自然病程，具有良好的临床耐受性，住院期间密切观察患儿病情变化，及时处理并发症，可显著改善患儿病情并缓解患儿家长的焦虑情绪[2]。普萘洛尔通过抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达抑制血管瘤内皮细胞的增生，进而减少内皮细胞的迁移和血管增生，诱导内皮细胞凋亡，抑制血管的生成，从而抑制血管瘤的进展[6]。目前，婴儿血管瘤的发病机制尚未明确，但有研究表明，VEGF/血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)等多种信号转导途径与血管瘤的发病机制密切相关[7]。VEGF-A被认为是VEGF家族最重要的因子之一，不仅可生理性的促进血管形成，还在恶性肿瘤等疾病的进展过程中发挥重要作用[7-8]。本研究旨在探讨VEGF-A(+405G/C，rs2010963；+936C/T，rs3025039)及VEGFR-2(+1416T/A，rs1870377；-271G/A，rs7667298)的基因多样性与婴幼儿血管瘤患病风险的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年12月至2018年12月在河北省人民医院小儿外科入院治疗的58例血管瘤患儿作为观察组，选取同期58名健康婴幼儿作为对照组。纳入标准：①观察组血管瘤诊断明确；②入院前未接受其他治疗。排除标准：①合并肺炎、气管炎及哮喘等呼吸系统疾病或合并急性充血性心力衰竭等心血管系统疾病；②并发肝肾功能不全、其他恶性肿瘤等疾病病史；③出生时合并新生儿窒息或新生儿缺血缺氧性脑病；④参与者临床资料不完整或依从性差。两组性别、年龄、体重比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经河北省人民医院医学伦理委员会批准，所有受试者家属均签署知情同意书。

表1 两组受试者一般资料比较

对照组：健康婴幼儿；观察组：血管瘤患儿；a为χ2值，余为t值

1.2方法 测定VEGF-A和VEGFR-2的基因多样性，所有受试者在入院时抽取空腹静脉血10 mL，置于枸橼酸钠抗凝管中并在4 ℃冰箱中保存。在血液样本收集完成的1周内，应用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取受试者外周血白细胞DNA。

采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法扩增提取DNA，随后由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成引物。具体方法如下：①PCR反应体系：dNTPs 10 mmol/L，上游及下游引物各10 pmol/μL，PCR缓冲液2.4 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 2.0 μL。应用PCR扩增仪(PT-100型)进行扩增。反应条件：94 ℃预变性3 min，随后按94 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环后，在72 ℃延伸10 min。②PCR产物电泳检测反应结束后，将产物置于 0.5×TBE电泳液中，在100 V恒压水平电泳30 min，检测是否有特异性扩增产物产生。③限制性内切酶片段长度多态性分析：PCR酶切产物加入2%琼脂糖凝胶加样孔中，置于0.5×TBE电泳液中，在120 V恒压水平电泳30 min，随后取出放置于紫外光凝胶成像系统下观察带型，并将PCR产物纯化后测序。

2 结 果

2.1两组VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T位点的基因型和等位基因频率分布比较 观察组VEGF-A +405G/C、VEGF-A +936C/T的基因型频率以及G和T等位基因的基因频率均较对照组高(P<0.05)，见表2。

2.2两组VEGR2 +1416T/A 和VEGR2 -271G/A位点基因型和等位基因频率分布比较 观察组VEGR2 +1416T/A和VEGR2 -271G/A的基因型频率均较对照组高(P<0.001)；但观察组T和G等位基因的基因频率较对照组低(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

随着社会的发展和医疗技术的进步，目前婴幼儿血管瘤的治疗方法较多，逐渐多样化，主要分为非手术治疗和手术治疗，其中非手术治疗包括激光治疗、放射性核素及药物治疗等[9-11]。非手术治疗作为血管瘤的首选治疗方案，对大部分血管瘤患儿有效，但对一部分患儿的治疗效果欠佳，往往需要进一步的手术治疗消除病灶，增加了患儿和家长的心理压力以及家庭的经济负担[12]。

大量婴幼儿血管瘤相关研究报道了其发病机制的新发现，但具体分子机制尚不清楚[4,9-10]。VEGF/VEGFR-2信号通路在血管瘤发病机制中发挥重要作用，因此对影响VEGF和VEGFR的相互作用因素及其蛋白质表达水平的研究逐渐成为研究热点[13]。研究发现，增殖期血管瘤组织VEGF信使RNA的表达水平明显高于正常组织和消退期血管瘤组织[10]。另有研究发现，血管瘤组织分离培养的内皮细胞的VEGFR和血管生成素受体的表达水平明显高于正常组织分离的内皮细胞，提示血管瘤组织内VEGF和血管生成素受体的过表达可能是血管瘤的形成机制之一[11]。VEGF-A通过与内皮细胞表达的酪氨酸激酶受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和VEGFR-3(Flt-4)的特异性结合发挥特定作用，其中VEGFR-2在血管生成和通透性增加过程中的作用最重要[14-15]。研究表明，与消退期相比，增殖期血管瘤患者血清VEGF-A的表达水平明显更高[16]。体外研究也表明，血管瘤内皮细胞、血管瘤干细胞和血管瘤周细胞中VEGF的表达水平明显高于正常组织细胞[17]。VEGF基因存在多个位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，位于基因启动子或调节区域的SNP，可影响转录过程，进而影响蛋白表达，导致疾病易感性的个体差异[18]。

本研究中，VEGF-A 的SNP，即+405G/C(在5′非翻译区)和+936C/T(在3′非翻译区)，既往研究指出，+405G/C和+936C/T可显著影响VEGF的表达水平[19]。VEGF表达失调不仅与肿瘤疾病的发病机制密切相关，还与心血管疾病、子宫内膜异位症等疾病的发病机制密切相关[20-21]。本研究结果显示，健康儿童VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T的基因型频率为34.5%和29.3%，与Przewratil等[22]关于VEGF-A的+405G和+936C/T SNP位点GC与CT基因型频率大致相同的研究结论一致。本研究中，观察组血管瘤患儿的VEGF-A +405G/C、VEGF-A +936C/T、VEGR2 +1416T/A和VEGR2 -271G/A SNP位点基因型和等位基因频率与对照组儿童比较均存在差异，说明VEGF-A和VEGFR-2的基因多样性在血管瘤的发生和发展过程中起主要作用，可能与基因的转录过程有关，影响靶基因的蛋白表达。

表2 两组VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T位点基因型和等位基因频率分布比较 [例(%)]

对照组：健康婴幼儿；观察组：血管瘤患儿；a为χ2值，余为t值

表3 两组VEGR2 +1416 T/A和VEGR2 -271 G/A位点基因型和等位基因频率分布比较 [例(%)]

对照组：健康婴幼儿；观察组：血管瘤患儿；a为χ2值，余为t值

通过测定血管瘤患儿外周血清VEGF和VEGFR-2信使RNA的表达水平检验基因多态性与细胞因子表达水平相关性研究显示，+405G/C和+936C/T基因多态性个体血清的VEGF-A信使RNA表达水平明显高于对照组，且存在+405G/C基因多态性的GG纯合子个体的血清VEGF-A信使RNA表达水平最高[23]。

目前，对血管瘤发生和发展中VEGFR-2基因多态性的作用仍存在很大争议。血管瘤的病理学特点是血管内皮细胞增殖活跃，并伴有血管生成和肥大细胞的广泛聚集，而VEGFR-2是蛋白酪氨酸激酶家族成员之一，具有蛋白酪氨酸激酶结构域，可与VEGF结合激活相关信号通路，调控细胞的生物学行为[21]。一项横断面研究发现，普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤取得了满意的治疗效果，但血管瘤患儿和健康对照组婴幼儿在治疗前和治疗后血清VEGFR-2表达水平的变化差异均无统计学意义[24]。研究指出，VEGFR-2过表达对血管瘤内皮细胞磷酸化过程起重要作用[25]；动物实验研究发现，敲除VEGFR-2基因可明显抑制大鼠血管瘤内皮细胞的增殖过程[26]。有研究指出，VEGFR-2在血管瘤组织增生期的表达水平明显高于消退期；与消退期血管瘤组织和正常组织相比，血管瘤组织VEGFR-2基因上游启动子序列存在异常甲基化，进一步说明VEGFR-2基因的多样性，且VEGFR-2基因的异常甲基化可能在血管瘤组织发生、增殖及消退过程中发挥重要作用[27]。以上研究均表明，VEGFR-2的高表达及基因多态性在血管瘤发生和发展过程中起重要作用。由于本研究样本量较少，存在一定的局限性，研究结果可能存在一定偏倚，仍需要多中心大样本临床回顾性研究的进一步验证。

综上所述，VEGF-A和VEGFR-2的基因多态性与婴幼儿血管瘤患病风险存在相关性，VEGF-A和VEGFR-2的基因多样性可能是婴幼儿血管瘤发病的危险因素之一，通过对血管瘤易感人群的筛选以及疾病预防、早期诊断和早期干预的分子水平研究，有望提高血管瘤的治愈率，从而改善血管瘤患儿的预后。