Non-coding RNAs在肺纤维化发病机制中的作用的研究进展

郭玉娟，颜天华

中国药科大学 基础医学与临床药学学院，南京 210009

目前，肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）已成为全球范围内关注的健康问题，发病率和患病率高，患者的预后极差。由于没有特异性的治疗策略，多数患者死于进行性呼吸功能衰竭[1]。利用基因组学技术对肺纤维化的分子机制和新靶点进行研究，已成为目前的研究热点。基因组中大量基因并不编码蛋白质，却又会转录成非编码RNA （Non-coding RNAs，ncRNA）。其中微小 RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码 RNA（lncRNA）[2]在PF的病理过程和发病机制中研究较多，本文对此作一综述，旨在为探索肺纤维化的新治疗靶点提供参考。

1 非编码RNA

1.1 非编码RNA

ncRNA是一类内源的非蛋白质编码RNA，存在于各种细胞中，具有多样化的生物学功能。根据长度，ncRNA可分为两大类：（1）短 ncRNAs（＜200 个核苷酸），如 miRNA；（2）长ncRNAs（lncRNAs）（＞200 个核苷酸），如 lncRNA[3]。此外，还有一种闭合环状的内源性RNA，称为环状RNA（circular RNA，circRNA），不具有5'端帽子和3'端尾巴结构。

1.2 lncRNA的作用机制

lncRNAs通常定位在细胞核和细胞质中，它调控基因表达的机制有：（1）在表观遗传学水平：可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等形式，对生物体的表观遗传进行调控；（2）在转录水平；（3）在转录后水平：主要涉及 miRNA水平、mRNA水平和蛋白质水平；（4）在翻译水平：可作为竞争性内源RNA（ceRNA）与miRNA相互作用，或直接与mRNA结合，参与靶基因的表达调控；（5）在细胞外的调控：通过包裹在细胞外分泌物中于细胞之间转移[4，5]。

1.3 miRNA的作用机制

miRNA是一类长约18～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA。其作用机制主要有：（1）翻译抑制：在大多数情况下（主要是哺乳动物中），单链miRNA与靶mRNA不完全互补配对，抑制靶基因的翻译过程，从而调节基因表达。这种方式只影响蛋白质的翻译水平，并不影响mRNA的稳定性。（2）mRNA的降解：当miRNA与mRNA完全互补配对时，引起靶mRNA的降解，从而导致基因沉默。一个miRNA可以调控多个靶mRNA，而特定的mRNA也可以与多个miRNA结合，从而达到不同的调控效果[6，7]。

1.4 lncRNA与miRNA相互作用

lncRNA与miRNA的双向调节作用使其调控基因表达，共同影响多种疾病的发展过程。miRNA通过直接或间接方式调控lncRNA。当miRNA与lncRNA的3'UTR不完全匹配时，可直接负性调节lncRNA；miRNA也可以与其他分子相互作用，间接作用于lncRNA[8]。lncRNA调控miRNA可通过作为内源性miRNA海绵、与miRNA竞争性结合mRNA的3'UTR、剪切产生miRNA前体等途径[9]。

2 miRNA在肺纤维化中的研究现状

肺纤维化是一种由于过度的细胞外基质沉积而导致瘢痕形成的病理状态，与miRNA的失调有关。越来越多的研究正在筛选和鉴定在肺纤维化中失调的miRNA。miRNA可通过正或负调控其靶蛋白的表达而参与肺纤维化的过程。

2.1 let-7

let-7家族是发现最早、研究最深入的miRNA之一。其中let-7d在正常的肺泡上皮细胞中高丰度表达，能维持上皮细胞表型并抑制细胞过度增殖分化，是正常肺功能所必需的[10]。高迁移率族蛋白A2（HMGA2）是let-7的重要靶基因，也是上皮间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的激活剂。在肺纤维化中，TGF-β1能通过Smad3与let-7d的启动子结合来下调let-7d，从而减弱了let-7d对HMGA2的抑制，促进EMT，使肺泡细胞增厚和胶原沉积增加[11]。此外，RAS也是let-7家族的靶基因，与细胞增殖具有密切关系，也参与let-7抗 EMT效应[12]。

2.2 miR-21

miR-21是人肺中最常表达的miRNA，在肺纤维化的发病机制中起着重要的作用。miR-21在博来霉素（BLM）诱导的纤维化小鼠的肺中和特发性肺纤维化（IPF）患者的肺中表达增加，主要定位于肌成纤维细胞[13]。抑制miR-21可减轻纤维化和肌成纤维细胞分化的程度。miR-21能抑制smad7蛋白而促进TGF-β1/smad信号通路增强EMT的过程，反之，TGF-β1可增强miR-21的表达[14]。因此，miR-21是开发肺纤维化新疗法的潜在目标。

2.3 miR-29

miR-29家族由 miR-29a、miR-29b和miR-29c组成，能抑制细胞外基质（ECM）的合成，miR-29在肺纤维化中显著减少[15]，表明其具有抗纤维化功能[16]。miR-29的靶标包括ELN、FBN1、COL1A1、COL1A2 和 COL3A1 等 ECM 基 因[17]。Cushing L等[15]发现，在IMR-90细胞和BLM处理的小鼠肺中，miR-29及其下游靶基因COL3A1、COL4A1被 TGF-β1下调，使纤维化相关基因的表达上调，从而导致肺纤维化。Xiao J等[18]发现miR-29是Smad3的下游靶基因，在肺纤维化中受TGF-β/Smad信号传导的负调控。因此，miR-29是TGF-β介导的纤维化基因调节的重要促进因子。

2.4 miR-155

miR-155是正常免疫功能所必需的，其过度表达与炎症、自身免疫和癌症有关，而miR-155缺陷型小鼠则发生与年龄相关的气道纤维化。Pottier N等[19]发现，在用TNF-α和IL-1β处理人肺成纤维细胞后，miR-155的表达增加，而用TGF-β1处理后表达降低。miR-155的表达增加可使纤维化细胞因子7（FGF-7）的表达下调，促进成纤维细胞迁移。Kurowska-Stolarska M等[20]发现，miR-155敲除的小鼠出现肺纤维化加剧、胶原沉积增加、TGF-β产生以及巨噬细胞的活化。在肺成纤维细胞和巨噬细胞中，miR-155的靶基因肝X受体（LXR）α显著下调。说明miR-155/LXR途径可能具有治疗IPF的潜力。

2.5 miR-200

miR-200家族主要包括 miR-200a、miR-200b和 miR-200c，能维持上皮细胞表型并参与EMT进程[21]。研究发现，miR-200在肺纤维化小鼠和IPF患者肺中下调，并且miR-200s的表达增加可抑制TGF-β诱导的肺泡上皮细胞EMT发生，发挥抗肺纤维化作用[21]。miR-200s可通过E-cadherin的转录因子ZEB1和SIP1靶向抑制EMT。此外，miR-200能靶向抑制β-catenin基因的表达，从而调控Wnt/β-catenin信号转导途径的活性[22]。

3 lncRNA在肺纤维化中的研究现状

lncRNA虽不编码蛋白质，但能通过控制基因循环、调节mRNA剪接、调节mRNA衰变以及将染色体组织成基因邻域等方式调节转录[23]。

3.1MRAK088388和MRAK081523

Song X等[24]首次揭示了lncRNA可能在肺纤维化中作为ceRNA。在BLM诱导的肺纤维化大鼠模型中，发现两个上调的lncRNA MRAK088388和MRAK081523，它们的序列与肺纤维化中两个上调的基因 （N4bp2和Plxna4）高度相似。MRAK088388 和 N4bp2 对 miR-200、miR-429、miR-29 和miR-30具有相同的miRNA反应元件（MRE），而MRAK081523和Plxna4对miR-218、miR-141、miR-98和let-7具有相同的MRE。MRAK088388通过miR-29b-3p调节下游的N4bp2，而MRAK081523通过与let-7i-5p竞争性结合调控Plxna4表达。因此，MRAK088388和MRAK081523可作为ceRNA，促进成纤维细胞的增殖分化而导致肺纤维化的发生。

3.2 n341773和CD99P1

Huang C等[25]发现在IPF中lncRNA n341773和CD99P1的表达下调。n341773是miR-199的ceRNA，其表达和功能与miR-199的表达和功能呈负相关[26]。在LL29细胞中，n341773的下调使肺成纤维细胞中胶原蛋白的表达增加。CD99P1虽具有miR-101的结合位点，但两者的表达和功能并不相关。而CD99P1的敲除能抑制α-SMA的表达和成纤维细胞的增殖。由于α-SMA是成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的标志，CD99P1和n341773可能参与肺成纤维细胞增殖和分化的调节。

3.3 uc.77和05Rik

在百草枯诱导的肺间质纤维化小鼠中，发现两个上调的lncRNA uc.77和05Rik，它们分别调节靶基因Zeb2和Hoxa3（EMT的关键调节剂）的表达而引起EMT，导致肺纤维化[27]。uc.77的过表达可增加Zeb2的表达，而05Rik的过表达则抑制Hoxa3的表达。uc.77和05Rik的过表达改变EMT标志物的表达，如降低E-cadherin的表达、增加Vimentin和α-SMA的表达，表明uc.77和05Rik通过调节EMT在肺纤维化中发挥作用[28]。

3.4 H19

lncRNA H19在胎儿组织和成人肌肉中大量表达，具有发育调节作用，与人类遗传疾病和癌症有关[29]。H19含有let-7家族的结合位点，可以充当靶基因let-7的ceRNA，调节let-7的转录表达。let-7过表达能减轻H19敲除引起的早熟肌肉分化[30]。H19在BLM诱导的小鼠中和TGF-β诱导的成纤维细胞中上调，并且其敲除能改善肺纤维化症状。H19直接与 miR-29b的 3'UTR相互作用，抑制 miR-29b，使COL1A1表达增加，表明H19通过miR-29参与肺纤维化[31]。此外，H19是miR-196a的直接靶标，通过与miR-196a竞争作为ceRNA来调节COL1A1[32]。因此，H19对BLM诱导的IPF具有促进作用，为IPF提供了新的治疗靶标。

3.5 lincRNA-p21

LincRNA-p21在细胞增殖、凋亡和DNA损伤反应中发挥重要作用，如调节血管内皮细胞的生长和角质形成细胞的凋亡等[33]。LincRNA-p21 作为“肿瘤抑制因子 ncRNAs”或“致癌ncRNAs”，位于p53调节基因的启动子中，调节p53介导的凋亡途径中的基因表达[34]。在脂多糖（LPS）处理的肺成纤维细胞和小鼠模型中[33]，lincRNA-p21随着Thy-1的下调而上调。Thy-1糖蛋白在正常的肺成纤维细胞中表达，但在IPF的成纤维细胞灶中不表达。Thy-1能影响纤维化表型，起到“纤维化抑制剂”的作用[35]。LincRNA-p21过表达可促进成纤维细胞的增殖，抑制H3和H4在Thy-1启动子上的乙酰化以及HLF1细胞中Thy-1的活性，参与肺纤维化的发生发展。

4 小 结

ncRNA是肺纤维化中重要的调节因子，在肺纤维化发病机制中发挥重要的作用。目前的药物开发重点是通过单分子检测分析等新技术，来降低成本并提高lncRNA和miRNA生物测定的准确性。增加lncRNA和miRNA生物标记领域的标准化，例如寻找可靠的数据标准化因子，可进一步提高结果的准确性和可重复性。