D-半乳糖联合脱氢表雄酮诱导小鼠多囊卵巢综合征模型

史成良，宋春雨，王单，齐晓娟

(齐齐哈尔医学院，齐齐哈尔 161006)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女最常见的内分泌紊乱，也是引起不孕的常见病因，其发病率约占育龄期女性的5%～10%，主要以卵巢形态学改变为基础、并且伴有长期排卵和月经失调以及高雄激素血症等症状[1]。PCOS还与很多疾病的发生发展密切相关，如肥胖症、2型糖尿病、血脂异常、高血压等，因此该综合征已经成为妇科内分泌领域的研究热点[2]。PCOS临床表现为高度的异质性，其发病因素涉及下丘脑、垂体、胰腺、肾上腺、卵巢及遗传等诸多因素，但其发病机制目前尚无定论，为探究PCOS的发生、发展及预防、治疗，已建立了很多种动物模型，但由于PCOS具有高度的异质性，目前尚无能够囊括PCOS全部特征而被公认的标准动物模型。因此，仍然需要科研工作者去寻找能够符合PCOS特征的更加理想的实验动物模型。

D-半乳糖通常可引起大脑、肾脏、肝脏、血细胞等多种器官组织的损伤及衰老，常用于多种器官早衰动物模型的制备[3]。国外学者Park等[4]提出：D-半乳糖也可诱导ICR雌性小鼠PCOS表型;国内学者周越等[5]也报道了D-半乳糖可诱导建立ICR雌性小鼠PCOS模型，本实验在此基础上采用D-半乳糖联合脱氢表雄酮(DHEA)诱导小鼠PCOS模型，探讨能够符合PCOS特征更理想的动物造模方法以满足临床研究的需要。

材料和方法

一、实验动物

清洁级ICR小鼠48只，雌性，20周龄，体重(40±2)g，购于哈尔滨医科大学实验动物部(许可证号SCXK(黑)2013-001)。所有实验动物均分笼饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心(许可证号SYXK(黑)2016-001)。按照3R原则给予使用的实验动物人道主义关怀，环境温度为(22±2)℃，相对湿度40%～60%，所有小鼠均可自由饮水及进食，并且每天给予12 h日光灯照明。

二、仪器与试剂

D-半乳糖、DHEA、注射用大豆油(武汉远成共创科技)；血糖试纸和血糖仪(上海强生医疗器械)；石蜡包埋机、旋转切片机、烘片机(Leica，德国)；光学显微镜(Nikon，日本)；图像采集分析系统(Leica，德国)。

三、药物的制备及储存

将4克D-半乳糖溶于100 ml生理盐水制备成工作液，4℃储存，以200 mg/kg剂量腹腔注射；将1.4克DHEA溶于100 ml注射用大豆油中制备成工作液，4℃储存，以70 mg/kg剂量颈背部皮下注射，注射前充分搅拌。

四、实验方法

1.动物模型制备和实验分组：48只ICR小鼠随机分成正常对照组、DHEA组、D-半乳糖组和D-半乳糖联合脱氢表雄酮组(D+D联合组)，每组各12只。D+D联合组在颈背部皮下注射DHEA 70 mg/kg及腹腔注射D-半乳糖200 mg/kg，D-半乳糖组腹腔注射D-半乳糖200 mg/kg，DHEA组颈背部皮下注射DHEA 70 mg/kg，正常对照组在颈背部皮下注射等量的注射用大豆油及腹腔注射等量的生理盐水，每日1次，连续注射21 d。

2.取材：实验小鼠处死方法采用颈椎脱臼法，解剖取卵巢并观察卵巢的变化。以4%多聚甲醛固定卵巢后，石蜡包埋、切片、HE染色并做光镜检查。

3.饮食量及体重的测定：每周测定两次饮食消耗量及体重。

4.血糖值的测定：所有实验小鼠于实验的第21天隔夜禁食，次日用血糖仪在剪断的尾尖部取血，测定空腹血糖值。

5.动情周期的检查：自开始给药的第11天采集阴道脱落细胞涂片，连续10 d。每天下午5点用吸管吸取生理盐水约0.1～0.2 ml，轻轻插入小鼠的阴道内约0.5～1 cm，连续抽吸2～3次，再将吸液滴于载玻片上，滴入适量的95%乙醇溶液用以固定细胞，晾干后放置于普通光学显微镜下行细胞学检查。

五、统计方法

结 果

一、进食量变化结果

D+D联合组、DHEA组、D-半乳糖组与对照组相比进食量均有所降低，且D+D联合组、DHEA组显著低于对照组(P<0.05)(图1)。

图1 不同造模方法对摄食量的影响

二、体重变化结果

D+D联合组、DHEA组与对照组相比体重稍有增高，而D-半乳糖组与对照组相比体重稍有降低，但均无统计学差异(P>0.05)(图2)。

图2 不同造模方法对体重的影响

三、血糖值测定

D-半乳糖组、DHEA组及D+D联合组空腹血糖值与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)(图3)。

图3 造模21 d后空腹血糖值

四、动情周期的检测

经过连续10 d的涂片及镜下观察发现，各组动情周期变化如下(图4)。(1)对照组：呈明显的4～5 d的动情周期变化。(2)造模各组：DHEA组没有明显的动情周期的变化，表现为持续的动情间期，偶尔有动情后期的表现，提示没有排卵发生；D-半乳糖组无明显的动情周期的变化，表现为持续的动情间期，也提示没有排卵发生；D+D联合组无明显的动情周期的变化，表现为持续的动情间期或动情后期，亦提示无排卵发生。

五、病理学改变

(1)大体观察：对照组小鼠的卵巢形态正常，色泽红润；DHEA组小鼠、D-半乳糖组小鼠、D+D联合组小鼠的卵巢偏大，表面苍白，卵巢表面可见单个或较多的囊性扩张卵泡。(2)组织学：对照组100%(12/12)小鼠的卵巢在光镜下可见多个不同发育阶段的卵泡及黄体，颗粒细胞形态完整且排列整齐，多为8～9层(图5A)；DHEA组50%(6/12)小鼠的卵巢可见颗粒细胞层数变薄，排列松散，可减少至5～6层，黄体形成较少(图5B)；D-半乳糖组50%(6/12)小鼠的卵巢闭锁增多并且呈囊状扩张，卵泡膜细胞增生，卵泡内卵母细胞消失，卵巢颗粒细胞排列松散，层数减少至3～4层(图5C)；D+D联合组91.7%(11/12)小鼠卵巢可见较多囊状扩张的卵泡，较少见到黄体，卵泡内卵母细胞消失，颗粒细胞层数可减少至2～3层(图5D)。

每组展示4只小鼠的动情周期变化。E：动情期；P：动情前期；D：动情间期；M：动情后期图4 各组小鼠动情周期变化

A：对照组；B：DHEA组；C：D-半乳糖组；D：D+D联合组图5 各组动物卵巢形态学(HE染色 ×100)

讨 论

D-半乳糖通常可引起大脑、肾脏、肝脏、血细胞等多种器官组织的损伤及衰老，常用于多种器官早衰动物模型的制备[3，6]。然而D-半乳糖对雌性生殖器官的影响鲜有报道[1，4]。我们采用D-半乳糖联合DHEA诱导小鼠PCOS的模型显示能够使小鼠产生典型的PCOS特征，并且这些特征与单纯应用D-半乳糖或DHEA产生的PCOS特征更为符合其临床特征。

DHEA是一种雄性激素，主要在肾上腺合成，大部分可被硫酸化为硫酸盐释放进入血液[7]。王玉阁等[8]研究显示DHEA联合高脂饮食可诱导C57BL/6J雌鼠表现为空腹血糖及胰岛素水平升高，表现为胰岛素抵抗现象。有研究显示，DHEA处理的动物在代谢方面的表现更接近于PCOS患者，可导致体重增加、糖耐量异常及胰岛素抵抗等代谢特征[9-10]。周越等[5]研究显示D-半乳糖诱导ICR中年雌性小鼠PCOS动物模型，显示模型组小鼠卵巢重量显著高于对照组，单侧或双侧卵巢呈现多囊性扩张，卵巢闭锁增多及颗粒细胞层数减少，并表现为紊乱的动情周期。Park等[4]研究报道应用D-半乳糖可诱导小鼠PCOS综合征样表型，模型小鼠动情周期紊乱及卵巢呈囊性扩张，AMH及雄激素水平升高。

虽然PCOS的病因复杂，临床表现具有明显的异质性。主要表现为生殖及代谢两个方面，生殖方面的表现主要体现为多囊性卵巢，代谢方面的表现主要是血脂异常、肥胖以及胰岛素抵抗等。多囊性卵巢的病理学改变是临床上诊断PCOS 的最重要的依据之一[11]。本研究发现D-半乳糖联合DHEA可明显引起ICR小鼠单侧或双侧卵巢囊肿以及多囊性改变，而正常对照组并未出现卵巢多囊样特征，且D-半乳糖联合DHEA能够明显诱发卵巢卵泡发生闭锁及囊状扩张卵泡改变，实验组91.7%小鼠可见此变化，与PCOS患者卵巢病理改变非常相似。单纯应用D-半乳糖或DHEA引致小鼠单侧或双侧卵巢囊肿及多囊性改变不甚明显，只有50%的小鼠可见此改变。另外，本研究发现D-半乳糖联合DHEA明显引致小鼠动情周期紊乱，表现为卵泡发育障碍、不排卵或稀发排卵，表现出明显的生殖方面的改变。本研究发现D+D联合组、DHEA组、D-半乳糖组与对照组相比进食量均有所降低，但D+D联合组、DHEA组与对照组相比有显著差异，D-半乳糖组与对照组相比无显著差异。本研究中，D+D联合组与DHEA组与对照组相比体重稍有增高，与Solano等[9]及Dowling等[10]的研究结果一致；D-半乳糖组与对照组相比体重稍有降低，与李婧等[6]的研究结果一致。另外，在分析摄食量与体重的关系时发现，应用DHEA的PCOS模型组小鼠与对照组相比摄食量减少，但体重却有增加的趋势；而应用D-半乳糖的PCOS模型组小鼠与对照组相比摄食量没有显著差异，但体重却有减少的趋势。说明DHEA和D-半乳糖在诱导PCOS模型中代谢方面的表现是有一定差别，但并未表现出非常明显的变化。本研究发现D-半乳糖组、DHEA组及D+D联合组空腹血糖数值与正常对照组相比没有显著差异。说明DHEA和D-半乳糖在诱导PCOS模型中并未改变胰岛素敏感指数，其机制需进一步研究。

尽管目前国内外已经建立了很多种PCOS实验动物模型，例如雄激素造模法、雌激素造模法、来曲唑造模法、芳香化酶抑制剂造模法、胰岛素联合HCG造模法、孕激素联合HCG造模法等[12-13]。但是这些模型仍然存在着不同程度的局限性，如可以诱发出卵巢的多囊性改变的注射外源性雄激素造模法，在形态学和激素的改变等方面与人的PCOS症状还是有很大的差别[14]；另外硫酸普拉睾酮钠、硫酸普拉睾酮钠联合HCG、来曲唑虽然也可诱导出PCOS模型，但临床上PCOS患者的胰岛素抵抗现象却未能体现[15]。所以科研工作者们仍需不断的尝试和探索新的造模方法，以求建立更加理想及更符合临床症状的PCOS动物模型。

本研究采用了D-半乳糖联合DHEA处理中年ICR小鼠诱导建立一种新的PCOS动物模型，结果发现实验小鼠呈典型的PCOS卵巢多囊性改变，无排卵等表现，联合组在生殖方面的改变比D-半乳糖组及DHEA组更明显，其特点与PCOS临床症状非常相似，符合临床研究需要。该方法操作简单、结果可靠，是一种建立PCOS动物模型理想的选择。