调强放疗前后外周血淋巴细胞及其亚群的变化分析

杨 婧，高 劲，肖 亮，王 芬，金问森，熊 那,4

放射治疗(radiotherapy，RT)是治疗中晚期肿瘤的重要方法，也是早期肿瘤手术后的补充手段，能够明显提高患者的生存时间。但是，RT在杀伤肿瘤细胞的时候，也会对机体的正常组织及细胞产生影响。一般来说，人体淋巴细胞对放射线有着较高的敏感性，而RT可引起部分淋巴细胞的再分布甚至死亡，从而导致人体免疫系统的改变[1]。随着RT技术的日新月异，调强放疗(intensity-modulated radiotherapy，IMRT)已被广泛地应用于头颈胸腹等全身各部位恶性肿瘤的治疗，它具有靶区剂量高，而对正常组织损伤却较小的特点[2]。该研究对183例常见肿瘤(肺癌、食管癌、鼻咽癌和直肠癌)患者IMRT前后的外周血淋巴细胞亚群的变化进行综合分析，为今后在IMRT中更为有效地保护免疫系统，以及免疫调节方面的治疗提供一定的研究依据。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2015年10月～2017年11月安徽省立医院西区放疗科收治的食管癌、肺癌、鼻咽癌及直肠癌患者183例，其中男145例，女38例，年龄13～89岁，中位年龄58岁。入组标准：患者无免疫系统疾病，且入院前未接受其他免疫方面治疗。患者IMRT前后行外周血淋巴细胞及其亚群检测，其中66例行免疫功能测定，117例行调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)检测。患者一般资料见表1。

表1 患者的一般资料

1.2研究方法和试剂

1.2.1主要试剂 CD3、CD8、CD45、CD4、CD16、CD56、CD19、CD127鼠抗人单克隆荧光抗体均购自美国BD公司，红细胞裂解液购自上海碧云天生物技术公司，其他均为国产市售常用试剂。

1.2.2放疗方法 采用GE Discovery CT模拟定位机增强扫描后，扫描图像传输至Pinnacle放疗计划系统，勾画大体肿瘤体积(gross tumor volume，GTV)、大体肿瘤转移淋巴结体积(gross tumor volume lymph gland，GTVnd)和相应淋巴引流区，即临床靶体积(clinical targer volume，CTV)，通过3D外扩获得计划靶体积(planning targer volume，PTV)。依据GTV、GTVnd和CTV外扩的PTV，给予不同的放疗剂量，周围正常组织给予合理剂量限值，制定放疗计划进行照射。食管癌、肺癌、直肠癌放疗剂量均在50～60 Gy，鼻咽癌为68～70 Gy。采用Varian trilogy 5339直线加速器，6 MV-X线照射，常规分割为1.8～2.2 Gy/次，1次/d，5 d/周，每周行kV级锥形束CT图像引导，检测和校正患者的放疗体位。

1.2.3流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测 患者分别于IMRT开始时和结束后1个月时抽取空腹静脉血2 ml，乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝。取100 μl全血加入不同抗体的混合液20 μl，4 ℃避光孵育30 min。加入1 ml红细胞裂解液，吹打混匀，裂解5 min，离心后弃上清液。PBS清洗细胞，重复2次，加入250 μl染色缓冲液重悬细胞后，采用FCM进行检测，以FlowJo分析软件进行淋巴细胞及亚群分析。

2 结果

2.1IMRT前后淋巴细胞总数的变化治疗前淋巴细胞总数均值为(1.592±0.491)×109个/L，治疗后的淋巴细胞总数均值为(0.739±0.342)×109个/L，以配对设计t检验进行统计学分析，结果显示IMRT前后患者血液中的淋巴细胞总数差异有统计学意义(t=15.12，P<0.01)，表明IMRT可以导致肿瘤患者外周血中的淋巴细胞总数显著降低。见图1。

2.2IMRT前后总T(T)细胞、辅助性T(helperTcell,Th)细胞和抑制性/细胞毒性T(suppressorTcell/cytotoxicTcell,Ts/Tc)细胞的水平变化治疗后的CD3+T细胞和CD3+CD4+Th细胞占淋巴细胞百分比(均值分别为68.200%±13.902%、27.871%±9.167%)明显降低，与治疗前(均值分别为71.251%±9.475%、40.739%±9.68%)相比较，T细胞平均下降3.05%(t=2.189，P<0.05)，Th细胞平均下降12.87% (t=9.962，P<0.01)，然而，治疗后患者血液中的CD3+CD8+Ts/Tc细胞占淋巴细胞的百分比(均值37.405%±13.026%)升高，较治疗前(均值28.439%±8.444%)平均增加8.96%(t=-6.403，P<0.01)。见图2。进一步计算患者治疗前的CD4+细胞/CD8+细胞比值为1.645±0.763，而治疗后的CD4+细胞/CD8+细胞比值为0.862±0.466，差异有统计学意义 (t=9.339，P<0.01)。上述结果提示，IMRT导致患者血液中T细胞和Th细胞的百分比降低，Ts/Tc细胞的百分比较IMRT前升高，从而造成CD4+/CD8+比值的明显下降。

图1 IMRT前后患者血液中淋巴细胞总数的变化

2.3IMRT前后Treg的水平变化CD4+和CD25+是Treg细胞的标志，并且CD127低表达(CD127low/)为Treg细胞的重要标志，因此，进一步检测患者治疗前后血液中CD4+CD25+CD127low/-的Treg细胞占CD4+T细胞的百分比，治疗前均值为6.270%±1.900%，治疗后为5.802%±1.850%，如图3所示，患者治疗后血液中的Treg细胞水平下降，平均降低0.47%，与治疗前比较，差异有统计学意义(t=2.17，P<0.05)。

2.4IMRT前后自然杀伤细胞(naturekillercell，NK)和B细胞的水平变化与T细胞和B细胞相比，NK细胞表面标志具有相对特异性，CD3-和CD16+、CD56+为NK细胞检测的常用标记。CD3-CD16+CD56+NK细胞的检测结果显示，患者IMRT前外周血NK细胞占淋巴细胞百分比均值为19.420%±9.688%，IMRT后为23.723%±11.909%，与治疗前外周血NK细胞水平相比增加4.3%，结果显示差异有统计学意义 (t=-3.697，P<0.01)。由于CD19存在于除浆细胞以外的几乎所有B细胞表面，因此，CD3-和CD19+常作为B细胞的检测标记。检测结果显示，患者治疗后CD3-CD19+B细胞水平(均值5.037%±4.106%)平均下降1.65%，与治疗前(均值6.726%±3.240%)比，差异有统计学意义 (t=2.973，P<0.01)。见图4。

图2 IMRT前后血液中T、Th和Ts细胞的水平变化

3 讨论

传统放疗可引起肿瘤患者血液中淋巴细胞总数的下降，这种效应的机制为放射线直接杀伤循环淋巴细胞和射线对骨髓的抑制导致淋巴细胞增殖和分化减少。在现代放疗中，普遍采用IMRT治疗肿瘤，其靶区精确度高，摆位误差小，能最大限度的保护肿瘤附近的正常组织。其对骨髓的抑制作用也较小，因此，淋巴细胞数目的减少主要原因是IMRT的直接杀伤作用[3]。在本研究中观察到IMRT引起患者外周血淋巴细胞的数量明显下降，并且这种下降在治疗结束后4周尚未完全恢复，提示尽管IMRT对机体正常组织损伤较小，但是对高度敏感性的淋巴细胞仍然具有很强的杀伤作用。

T淋巴细胞是形成并促进机体免疫应答的重要组分，其中CD3+CD4+Th细胞可通过扩增辅助B淋巴细胞产生抗体，并可活化其他的T细胞亚群，进而调节机体的免疫应答，在抗肿瘤和炎性反应的调节中具有重要作用，而CD3+CD8+Ts/Tc细胞则具有杀伤和抑制靶细胞的作用，在抗肿瘤方面能够直接杀伤肿瘤细胞[4]。通常情况下，CD4+/CD8+细胞比例保持相对稳定，以达到机体免疫稳态。本研究中IMRT后患者外周血中的Th细胞百分比下降，而Ts/Tc细胞比例升高，导致CD4+细胞/CD8+细胞比值进一步降低，提示IMRT诱导了患者外周血中T细胞亚群的再分布。Tao et al[5]在鼻咽癌患者IMRT的研究中，发现治疗后外周血Th细胞占淋巴细胞百分比与分期呈负相关，而CD4+/CD8+细胞比值降低可明显增加肿瘤远处转移的风险。Yang et al[6]也发现前列腺癌放疗有效的患者外周血中CD4+细胞/CD8+细胞比值明显高于无显著疗效的患者。

CD4+CD25+Treg细胞是CD4+T淋巴细胞的一个亚群，能够通过抑制T细胞的活化和增殖、下调白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的分泌，以抑制抗肿瘤的免疫反应，同时在肿瘤治疗中也起到维持免疫平衡、防止过度炎性反应和损伤的作用[7]。Foxp3+是CD4+CD25+Treg细胞的标志分子，而Foxp3+具有良好的相关性，CD4+CD25+CD127low/-细胞包含了绝大多数的Foxp3+细胞，通常情况下，以CD4+CD25+CD127low/-进行Treg细胞分选[8]。部分临床研究[9-10]表明，放疗可导致患者血液中Treg细胞的增加，与其他T淋巴细胞亚群CD127low/-与相比，Treg细胞的放射敏感性相对较低。而本项研究结果提示，肿瘤患者在IMRT结束后4周，外周血中Treg细胞的比例并未升高，反而出现降低，可能与检测时间的差异和样本数量有关。Cao et al[11]研究显示，CD4+CD25+Treg细胞受到电离辐射后，其凋亡相关蛋白(caspase-3、Bax和CD95)都高于CD4+CD25-T淋巴细胞，从而导致CD4+CD25+Treg细胞具有高放射敏感性，与本项研究结果相似。

图4 IMRT前后血液中NK和B细胞的水平变化

NK细胞属于固有免疫细胞，在机体受到抗原和外界刺激时，首先快速启动固有免疫应答，其中NK细胞表面高表达Fcγ受体(CD16)，与配体结合后，分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，发挥炎性反应和抗肿瘤作用，B细胞可分化为浆细胞，合成和分泌免疫球蛋白[12]。本研究结果显示，IMRT患者外周血中的NK细胞百分比升高，而B细胞的百分比降低。此现象是由于NK细胞中含有大量还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，能够有效清除由电离辐射激发水分子所形成的活性氧和自由基，具有很强的抗氧化能力，所以对电离辐射的耐受性高[3]，而Sage et al[3]和Jiang et al[13]则在肿瘤放疗的研究中发现，B细胞与其他淋巴细胞亚群相比较，具有更高的放射敏感性。

综上所述，IMRT可以导致肿瘤患者外周血淋巴细胞及其亚群的变化，从而对免疫功能产生影响，并且在治疗后的短时间内不能恢复正常。因此，需要及早给予免疫调节治疗，如IMRT过程中和结束的早期，以促进免疫平衡的恢复，预防辐射导致的过度炎性反应及诱发的二次致癌效应。