鸡豆黄素A对围绝经期抑郁症大鼠的神经保护作用及机制研究

杨 琴，梁 枫，李正姐，贺志鹏， 黄超娟，丁楚涵，尹艳艳

围绝经期抑郁症(perimenopausal depression disorder, PDD)是女性抑郁症的常见类型，其典型表现为明显抑郁，同时伴有焦虑紧张认知障碍等症状，给患者自身及家属带来极大的心理及生活困扰。目前临床上多采用雌激素替代疗法或雌激素联合抗抑郁药治疗PDD，该方法虽疗效肯定，但激素长期应用的诸多禁忌及潜在致癌性迫切需求疗效可靠、副作用小的治疗药物。PDD的发病原因比较复杂，外界环境刺激及体内雌激素水平下降被认为是PDD的主要发病原因[1]。雌激素与相应受体结合后通过基因与非基因效应调控靶基因的转录与表达、影响单胺类神经递质合成、促进神经元生长、抑制神经元凋亡及调控cAMP脑源性神经营养因子(cyclic adenosine monophosphate brain-derived neurotrophic factor，cAMP-BDNF)信号通路等机制发挥保护作用[2-3]。

鸡豆黄素A(biochanian A, Bioch A)是一种大豆异黄酮类化合物，研究[4]表明Bioch A与雌二醇结构相似性，可以与雌激素受体结合发挥雌激素效应，对激素引起的相关性疾病具有一定的保护作用。另外大量研究[5-7]发现Bioch A还具有抗炎、抗增殖、抗凋亡、抗肿瘤并且对阿尔茨海默病模型小鼠具有一定的缓解作用。但有关Bioch A对PDD的影响及机制研究未见报道。该研究采用目前公认的大鼠双侧卵巢摘除(ovariectomy，OVX)与慢性不可预知性温和应激[8](chronic unpre-dictable mild stress，CUMS)两步法建立大鼠PDD模型，通过行为学、分子生物学等方法及手段，探讨Bioch A对PDD模型大鼠的神经保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，SPF级，体质量180～220 g，购自上海杰恩捷实验动物有限公司。动物在温度为(25±2) ℃，湿度<60%，光照时间为7:00～19:00 环境中饲养。实验前禁食12 h，不禁水。

1.2药物及试剂Bioch A(纯度98.2%)购自西安开来生物工程有限公司；氟西汀购自法国patheon公司；去甲肾上腺素(arterenol，NA)、多巴胺(dopamine，DA)及五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)标准品购自美国Sigma公司；抗白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)兔单克隆抗体、抗半胱氨酸天门冬氨酸蛋白水解酶-1(interleukin-1 converting enzyme，Caspase-1)兔多克隆抗体购自英国Abcam公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)、磷酸化cAMP 反应元件结合蛋白(phosphorylation cAMP response element binding protein，p-CREB)、酪氨酸激酶受体B(tyrosine protein kinase B，TrkB)抗体及兔抗BDNF抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化蛋白激酶A(phosphorylation protein kinase A， p-PKA)抗体购自美国CST公司；抗兔或抗鼠二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；LunimataTMCrescendo发光液购自美国Millipore公司。

1.3PDD大鼠模型的制备及分组大鼠正常饲养1周适应环境后开始造模，方法如下：用1%的戊巴比妥钠(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，俯卧于手术台，固定好腹部，用动物剃毛器将大鼠背部最末肋骨下方毛发剃净，进行常规消毒后于鼠背最末肋骨下，距脊柱1.5～2.5 cm处切一小口，当看见乳白色的脂肪团时将其拉出体外进行分离，脂肪团中包裹有黄红色呈细线状不规则的组织即为卵巢。将卵巢下方输卵管(包括脂肪)用细线结扎后剔除一侧卵巢，同法剔除另一侧卵巢。术后将剩余组织放回体内，然后缝合肌肉皮肤并消毒。假手术组仅切除卵巢旁与卵巢同体积大小的脂肪组织。术后精心饲养，1周后将大鼠分为假手术组、模型组、Bioch A(10、20、40 mg/kg)剂量组及氟西汀(2 mg/kg)阳性对照组，每组24只，分三批次完成，每次将各组大鼠分笼饲养。Bioch A和氟西汀用0.5%羧甲基纤维素钠充分混匀，于每日应激前1 h 灌胃给药，假手术组和模型组给予等体积(1 ml/100 g)的羧甲基纤维素钠灌胃，共计21 d。包括冰水游泳(4 ℃、5 min)，热应激(45 ℃、5 min)，摇晃(1次/s、15 min)，夹尾(将大鼠放入固定笼中，露出尾巴，用止血钳夹住距尾根部1 cm处，持续1 min)，禁水24 h，禁食24 h，居住环境改变(潮湿垫料)等，各应激因子按随机方法在21 d内应用，每日给予1种刺激，每种刺激累计使用2～3次，使大鼠无法预料何种刺激发生，以此避免发生适应性。CUMS见表1。

表1 CUMS

1.4行为学指标检测

1.4.1旷场实验(open filed test, OFT) 用一个80 cm×80 cm×40 cm的敞箱，地面由等大的25个方格组成，周围为黑色材料制成，室内为暗光。将大鼠放入反应箱中央，摄像系统记录动物在旷场内6 min的行为学表现，计算水平运动(3或4只脚同在一个格内计1分，穿越1格计1分，沿线行走每8 cm计1分)及垂直运动得分(大鼠站立次数，双前足离地1次为1分)。两只动物之间用75%酒精擦拭底部及四壁，避免对后面大鼠测试产生影响。实验在应激第22 天完成。

1.4.2强迫游泳实验(force swimming test, FST) 将大鼠单独置于水深20 cm的玻璃缸内(高40 cm，直径20 cm) ，水温22～25 ℃，游泳6 min，观察并记录后4 min内大鼠在水中累计不动时间的总和。每只大鼠实验结束后洗净水缸并换水，避免影响后面大鼠测试。实验在应激第22 天完成。

1.5大鼠海马组织单胺类递质含量的测定行为学测试结束后第2天，断头处死大鼠，开颅取脑，在冰台上迅速分离海马组织，组织称重后按每4 mg组织加1 ml含高氯酸0.1 mol/L和EDTA 0.1 mmol/L的蛋白沉淀液。用玻璃组织匀浆器将组织匀浆，于4 ℃条件下离心20 min后取上清液，上清液用0.22 μm滤器过滤后上机检测。单胺类递质经分析柱分离后再经电化学检测器进行定量检测，在色谱软件工作站显示并分析结果。通过标准品的保留时间和峰面积确定递质种类并计算递质浓度。

1.6Westernblot检测大鼠IL-1β及Caspase-1、p-PKA、PKA、p-CREB、CREB、BDNF、TrkB表达低温提取海马总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔上样50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分离样品，转膜，封闭，分别滴加GAPDH(1 ∶2 000)、IL-1β(2 μg/ml)、Caspase-1(1 μg/ml)、p-PKA(1 ∶1 000)、PKA(1 ∶1 000)、p-CREB(1 ∶500)、CREB(1 ∶1 000)、BDNF(1 ∶1 000)及TrkB(1 ∶1 000)一抗4 ℃过夜。洗膜，滴加相应二抗(1 ∶2 000)室温孵育1 h。洗膜后将高灵敏的LunimataTMCrescendo发光剂加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系统进行拍照，用Image J 1.43(National Institutes of Health)软件进行灰度值测量。将目的蛋白与内参蛋白(GAPDH)或非磷酸化蛋白灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

表2 Bioch A对PDD 大鼠行为学的影响

与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01

图1 Bioch A对PDD 大鼠海马IL-1β及Caspase-1表达的影响

2 结果

2.1BiochA对PDD大鼠行为学的影响与假手术组相比，模型组大鼠水平和竖直得分均明显减少，强迫游泳不动时间显著增加(P<0.01)。与模型组相比，Bioch A 20、40 mg/kg剂量组及氟西汀组水平和竖直得分均明显增加，而强迫游泳不动时间减少(F= 174.7、87.57、26.4，P<0.05，P<0.01)。见表2。

2.2BiochA对PDD大鼠海马单胺类神经递质变化的影响与假手术组相比，模型组大鼠海马组织DA、NA及5-HT的水平均明显降低(F=34.63、58.16、42.07，P<0.01)。与模型组相比，Bioch A 20、40 mg/kg剂量组及氟西汀组海马5-HT的水平均不同程度升高(P<0.05，P<0.01)。见表3。

2.3BiochA对PDD大鼠海马IL-1β及Caspase-1表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠海马IL-1β、Caspase-1表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比，Bioch A 20、40 mg/kg剂量组及氟西汀组海马IL-1β、Caspase-1表达水平均不同程度降低(F=43.09、58.24，P<0.05,P<0.01)。见图1。

表3 Bioch A对PDD 大鼠海马单胺类神经递质变化的影响

与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01

图2 Bioch A对抑郁症大鼠海马PKA及CREB磷酸化水平的影响

2.4BiochA对PDD大鼠海马PKA及CREB磷酸化水平的影响与假手术组相比，模型组大鼠海马PKA及CREB蛋白磷酸化水平均明显降低(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，Bioch A 20、40 mg/kg剂量组及氟西汀组海马PKA及CREB蛋白磷酸化水平均不同程度升高(F=177.6、164.0，P<0.05，P<0.01)。见图2。

2.5BiochA对PDD大鼠海马BDNF及TrkB表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠海马BDNF、TrkB 表达水平均明显降低(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，Bioch A 20、40 mg/kg剂量组及氟西汀组海马BDNF、TrkB 表达水平均不同程度升高(F=140.6、62.59，P<0.05，P<0.01)。见图3。

3 讨论

本研究显示与假手术组相比,模型组大鼠在旷场实验中水平与垂直运动次数明显减少，说明模型组大鼠活动度降低，对周围新鲜环境的好奇性降低；模型组大鼠海马组织DA、NA及5-HT的含量与假手术组相比均明显降低，可见PDD 大鼠出现了单胺类神经递质的紊乱，而与模型组比较，Bioch A 20、40 mg/kg剂量组及氟西汀组大鼠在矿场实验中水平与垂直运动次数明显增加，5-HT的水平均不同程度升高，提示Bioch A与氟西汀一样能够改善抑郁模型大鼠的行为，起到一定的抗抑郁作用。

抑郁症的发病机制非常复杂，目前认为5-HT等单胺类神经递质的功能降低在抑郁症的发生、发展中起关键作用[9-10]。而细胞因子可影响抑郁症患者大脑中单胺类神经递质的作用[11]，本研究显示与假手术组相比模型组大鼠海马中细胞因子IL-1β及Caspase-1表达水平均明显升高，说明炎症因子参与抑郁活动。研究[12-13]已证实神经元再生比较集中的海马颗粒细胞下层及其附近有磷酸化PKA及CREB的高表达，CREB不仅能增强海马神经元的整合和功能的可塑性，而且可直接调控BDNF的合成及转录。BDNF通过与其高亲和力受体TrkB结合后对神经元的生长、分化、存活及损伤后修复有重要的作用，并与长时程增强、学习、记忆有关[14]。实验证实，氟西汀等抗抑郁药均可激活腺苷酸环化酶，提高cAMP含量，上调cAMP-CREB功能，增加海马BDNF、TrkB的表达[15]。上述研究表明，抗抑郁药可以通过激活PKA，增强CREB的表达水平或磷酸化水平，进而介导BDNF的功能，促进海马神经元再生，可见cAMP-CREB-BDNF信号通路是抑郁症神经元再生关健性环节之一。本研究同时发现与假手术组相比，模型组海马组织PKA及CREB磷酸化明显降低，同时BDNF及TrkB 表达水平不同程度降低；与模型组相比，不同剂量Bioch A和氟西汀均能上调海马区PKA及CREB磷酸化水平，提高BDNF及TrkB表达水平。

图3 Bioch A对PDD 大鼠海马BDNF及TrkB表达的影响

综上所述，Bioch A可能降低海马IL-1β的含量，上调色氨酸羟化酶表达，促进5-HT的合成与释放，进而通过G蛋白偶联信号通路调节cAMP的活性，激活PKA进而磷酸化CREB，最终促进BDNF及TrkB的表达，促进海马神经元的再生而具有一定的抗抑郁作用。