一起奶牛腹泻病的病原学诊断

李然，汤承，岳华

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

本试验对2018年辽宁省某奶牛场送检的18份犊牛腹泻样本进行牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、沙门氏菌（Salmonella）和安氏隐孢子虫（C.andersoni）的PCR检测，现报告如下：

1 材料与方法

1.1 被检样本 2018年辽宁省某奶牛场送检的10～30日龄犊牛腹泻样本18份。病牛临床表现为体温升高，食欲减退，体重减轻，水样腹泻，部分粪便颜色为灰白色或淡黄色，部分病牛便中带血，混有气泡和肠黏膜。

1.2 主要试剂及仪器 TrizolTMReagent、Prime ScriptTM、2×Taq PCR Master Mix 等购于 TaKaRa公司；DNA MarkerⅡ购于宝生物工程（大连）股份有限公司；高速离心机5804购自Eppendorf公司；普通PCR仪、凝胶成像系统VersaDov2000、核酸蛋白电泳仪购自Bio-Rad公司。

1.3 参考毒株 BRV、BCoV、BVDV、Salmonella、ETEC及C.andersoni阳性样本均由西南民族大学动物医学实验室保存。

1.4 核酸提取 将18份犊牛腹泻样本与PBS缓冲液按照1∶3的比例涡旋混合，反复冻融3次，置于4℃离心机中10000r/min离心10min，取上清，分别进行RNA和DNA的提取。RNA的提取按照Trizol试剂盒（RNAiso Plus）说明书进行，并利用Prime ScriptTMRT试剂盒将RNA反转录成cDNA，置于-20℃待用。DNA的提取采用酚-氯仿法，置于-20℃待用。

1.5 PCR检测 参照文献[1-6]中有关BRV、BCoV、BVDV、Salmonella、ETEC 及 C.andersoni的检测方法，对18份犊牛腹泻样本的cDNA和DNA模板进行PCR扩增，检测引物见表1，由生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.5μL，扩增样本cDNA或DNA 2μL，ddH2O 7.5μL。PCR扩增条件为：94℃ 4min，94℃30 s，52～55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72℃ 5 min，30 个循环。取扩增产物经2%琼脂糖凝胶核酸电泳后，用凝胶成像系统进行检测。将阳性PCR产物送至生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果经BLAST比对。

表1 RT-PCR引物信息

2 结果

电泳结果显示：在18份犊牛腹泻样本中，有15份样本扩增得到BRV检测引物的特异性条带，大小约为231bp，检出率为83.3%（见图1），与GenBank中BRV序列的相似性为98%～100%；有16份样本扩增得到BCoV检测引物的特异性条带，大小约为230bp，检出率为88.8%（见图2），与GenBank中BCoV序列的相似性为94%～97%；有11份样本扩增得到BVDV检测引物的特异性条带，大小约为230 bp，检出率为61.1%（见图3），与GenBank中BVDV序列的相似性为97%～100%；这些样本中 BRV、BCoV、BVDV的混合感染率为50%（见表2）；而Salmonella、ETEC和C.andersoni检测引物均未检出。

图1 BRV电泳检测结果

图2 BCoV电泳检测结果

图3 BVDV电泳检测结果

从表2可见，BRV、BCoV和BVDV的检出率分别为83.3%、88.8%和61.1%，3种病原的混合感染率为50%。结合临床症状分析，可以确诊该奶牛场的犊牛腹泻是由BRV、BCoV和BVDV混合感染引起的，且混合感染情况较严重。

表2 BRV、BCoV和BVDV的混合感染情况

3 讨论

BRV是引起犊牛腹泻的最常见病原，可感染各个年龄段的牛，且多发于1月龄以内的犊牛，临床表现为水样腹泻，有时混有黏液或血液，严重时发生脱水甚至死亡，当发生继发感染时，死亡率会大大提升[7]。BCoV在世界范围内流行，是引起犊牛腹泻的重要病原，还可引起成年牛的冬痢和呼吸道疾病，给养牛业造成了巨大的经济损失[8]。BVDV感染可引起广泛的临床症状，包括发热、腹泻、母畜流产、免疫抑制，并时常伴有继发感染，对奶牛的生产性能和繁殖性能影响较大[9]。

在我国，牛群中BRV、BCoV和BVDV的感染率较高，尤其是混合感染严重，提示我们在防控工作中应加强对BRV、BCoV和BVDV的监测。