微波水解-HPAEC-PAD法快速测定乳粉中的皮革水解蛋白

(1.宁波海关技术中心，宁波 315012 ；2.浙江工商大学,杭州 310018)

动物皮革水解蛋白是将皮革边角、甚至动物毛发等下脚料，经加工后制成的水解蛋白质。某些非法厂家为降低生产成本，在乳粉中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质[1]。但皮革下脚料中含有金属铬，长期食用含有“动物皮革水解蛋白”的食物，易引起重金属中毒。为此，国家卫生部于2009年2月公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》的通知中明确规定乳及乳制品、含乳饮料中禁止添加皮革水解蛋白。而羟脯氨酸则是皮革的主体蛋白-胶原蛋白中特有的氨基酸[2]。而乳蛋白质则不含羟脯氨酸，因此常将羟脯氨酸含量作为奶粉及乳饮料产品掺假与否的证据。

样品的前处理方法对后期的检测尤为重要[3]，水解蛋白质常见的方法有酶水解、酸水解和碱水解。其中酶水解因成本高而很少使用，碱水解会使部分氨基酸发生旋光异构，酸水解较彻底，且不引起消旋，是较为常用的方法，耗时较长[4]。微波酸水解最新发展的快速、彻底的一种前处理手段。

羟脯氨酸的测定方法很多，主要有比色法、氨基酸自动分析仪测定法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等[5-10]。其中比色法[8]操作简单、经济实用，但缺乏分离手段，易出现假阳性。液相色谱法、氨基酸分析仪都经过衍生后方可被检测，而衍生试剂容易污染环境，不符合绿色化学的理念[9-10]。

本实验采用微波水解作为样品前处理方法，使水解时间从传统法的16 h缩短至30 min。L-羟脯氨酸的检测采用ICS-5000离子色谱仪，以AminoPacTMPA10阴离子交换柱为分离柱，采用梯度洗脱，脉冲安培检测。该方法样品处理简单快速，结果准确可靠，可大致反映乳粉中皮革水解蛋白的添加量。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与耗材

Thermo ICS-5000离子色谱仪(包括DP四元梯度泵和SP单泵，DC控制单元，EG淋洗液发生器，AS自动进样器)、Chromeleon 6.8色谱工作站、Milli-Q Direct超纯水系统(美国默克密理博公司)；DGG-9053AD 电热恒温鼓风干燥箱；HH-2 数显恒温水浴锅；723 PCS可见分光光度计、TOPEX 全能型微波化学工作平台(上海屹尧仪器科技发展有限公司)；Vortex-Genie 2 漩涡混合器；SK8210HP 超声波清洗器；SARTORIOUS QUINTIX213-1CN 电子天平；Mettler Toledo XS205 DualRange 分析天平；Eppendorf Research移液枪(20～200 μL，500～1000 μL，5000 μL)。

NaOH(Fluka)、乙酸钠(Thermo)为色谱纯；L-羟脯氨酸(Sigma)为优级纯；氢氧化钠、冰乙酸、盐酸，硫酸、4-(二甲氨基)苯甲醛、明胶、氯胺-T、正丙醇、异丙醇、三氯乙酸、一水柠檬酸、无水乙酸钠均为沪试分析纯。

Bond Elut C18柱(Agilent)；WondaDisc水系针头滤器 MCE 0.22 μm(Shimadzu-GL)。

1.2 样品预处理

1.2.1 传统烘箱酸水解法

在50 mL塑料离心管中加入0.4 g乳粉、500 μL明胶溶液(15 g/L)、6 mL硫酸溶液(3 mol/L)，盖紧管盖，随后在漩涡混合器中混合均匀。在105 ℃烘箱中放置16 h，反应完毕，取出离心管，趁热加水至40 mL，待冷却用水定容。

1.2.2 微波酸水解法

在聚四氟乙烯反应罐中加入0.4 g乳粉、500 μL明胶溶液(15 g/L)、6 mL硫酸溶液(3 mol/L)，盖紧罐顶，置于微波消解器中，设置温度梯度为100 ℃水解1 min、155 ℃水解30 min。反应完毕，取出反应罐，将水解液转移至50 mL离心管中，随后用30 mL水分3次洗涤反应罐，待冷却后用水定容。

1.3 离子色谱法

水解液振荡均匀，先过C18柱，取滤液，滤液稀释100倍，再用0.22 μm水系膜过滤，上机。

色谱条件：色谱柱：DionexAminoPacTMPA10分析柱(2 mm×250 mm)，AminoPacTMPA10保护柱(2 mm×50 mm)；检测器：脉冲安培检测器，金工作电极，pH参比电极，氨基酸检测电位；流速：0.25 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：25 μL。淋洗液梯度程序见表1。

表1 淋洗液梯度程序

2 结果与讨论

2.1 微波酸水解样品预处理

2.1.1 酸种类的确定

在试验过程中发现，同为16 h的烘箱酸水解，采用盐酸水解的缺点也是显而易见的，即容易挥发导致水解不彻底。而采用硫酸水解过程中，因水分蒸发而会引起样品碳化，因此采用温度梯度的水解方式，减少水分蒸发。

2.1.2 微波水解温度探索

本实验采用温度梯度的水解方法[11]，即梯度一为100 ℃水解1 min，梯度二为水解温度和时间的变量，在梯度二中设置水解时间为5 min，以尽可能减少样品的碳化。采用1.3比色法测定L-羟脯氨酸的含量，比较120、140、145、150、155和160 ℃下样品的水解程度，结果表明，在155 ℃下样品的水解效果较好(见图1所示)。

图1 L-羟脯氨酸与水解温度的关系

2.1.3 微波水解时间探索

确定最佳微波水解温度为155 ℃后，同2.1.2方法对微波水解时间进行探索，结果发现水解时间在30 min时，水解效果较好(见图2所示)。值得注意的是，除了30 min水解时间点外，其余时间点的样品可能由于未彻底水解或过水解，导致同一水平间，其平行性较差。

图2 L-羟脯氨酸与水解时间的关系

2.2 离子色谱法测定L-羟脯氨酸的研究

2.2.1 NaOH淋洗梯度程序的选择

对NaOH淋洗液淋洗条件进行试验，采用18%

NaOH溶液(0.25 mol/L)和82%水作为梯度洗脱的初始程序分离度最好，假阳性现象降到最低水平。

2.2.3 线性关系

分别配制L-羟脯氨酸含量为0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.150 mg/L、0.200 mg/L的系列标准溶液，按1.4节方法进行测定，以峰面积值(y，nC·min)对浓度(x，mg/L)进行线性回归，得线性方程y=18.42707x，r2=0.9999。

2.2.4 加标回收率、检出限及定量限

按1.2.2水解方法将15 g/L明胶溶液分别替换为0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.200 mg/L的系列标准溶液，分别测定其回收率，并作6次平行。结果表明回收率分别在92.91 %、102.55 %、94.51 %，标准偏差(RSD)分别为3.91 %、5.34 %、1.30 %，加标回收率和重复性都较好。根据3倍基线噪音，确定检出限(LOD)为0.015 mg/L，定量限(LOQ)为0.050 mg/L。

2.3 方法比较与样品测定

微波酸水解-离子色谱法与传统的烘箱酸水解-比色法相比较。

表2表明，在120 ℃以上水解，两种测定方法计算数值较为接近，说明两种测定方法较为接近。

表3以比色作为检测方法，判断两种前处理方法是否对L-羟脯氨酸有破坏，从回收率来看，两种前处理方法对L-羟脯氨酸的影响较小。

表2 用微波酸水解法作为样品前处理方法，比较两种检测方法

表3 用比色法作为检测方法，比较两种样品前处理方法

3 结论

采用微波酸水解法对样品进行前处理，HPAEC-PAD检测，探索了水解温度、时间的影响，并优化了离子色谱的梯度淋洗程序，采用基于Au工作电极和pH参比电极的氨基酸检测电位、AminoPacTMPA10分离柱对水解液中的L-羟脯氨酸进行检测，方法灵敏度较国标法高，稳定性好。该方法通过L-羟脯氨酸的含量的分析初筛测定乳粉中添加的皮革水解蛋白，为乳粉掺假提供了有益的检测新方法。