超高效液相色谱-串联质谱法分析沿海贝类产品中的麻痹性贝毒

(1.浙江省海洋水产研究所，水产品加工与质量安全研究室，舟山316021;2.浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310035;3.浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，舟山316021;4.浙江海洋大学食品与医药学院，舟山 316022))

麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisonings，PSP)是由海洋中贝类通过非选择性滤食有毒海藻或其孢子，经食物链蓄积、转化生成的一类四氢嘌呤衍生物[1]。在多种贝类毒素中，PSP危害最大、发生频率最高、分布范围最广，严重威胁人类健康[2]。联合国卫生组织规定贝类可食用部分的PSP含量不得超过800μg STXeq/kg[3]。

目前PSP测定方法主要有小鼠生物法、ELISA法、细胞毒性测试法、毛细管电泳法[4]、液相色谱法[5]和液质联用法[6]。小鼠生物法无法定量毒素组分，ELISA法易产生假阳性，细胞毒性测试法难以迅速普及，毛细管电泳法适用性有限，液相色谱法前处理复杂。液质联用法可同时提供定性定量信息，已广泛应用于动物及环境中PSP的监测。本研究以超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)为分析手段，对沿海省份6类共99批次贝类产品中13种PSP进行了监测，为了解PSP在食用贝类中的污染和分布情况提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

扇贝、贻贝、牡蛎等贝类产品，购买于沿海各省市的流通市场和养殖区；PSP标准品购买于加拿大海洋生物科学研究所；乙酸：优级纯，上海国药集团；氨水：色谱纯，上海沃凯生物技术有限公司；乙腈：色谱纯，德国Meker公司；甲酸：色谱纯，上海国药集团。

1.2 仪器与设备

ACQUITY超高效液相色谱-质谱仪(美国Water公司)；石墨化碳黑固相萃取柱(250mg/3mL，美国Supelco公司)；Centrifuge5810高速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

样品前处理参考文献[7]：称取5g均质试样于50mL离心管中，加入5mL1%乙酸水溶液，涡旋混合90s，密封置于沸水浴5min，取出于流水冷却至室温。混合物4500r/min离心10min，取上清液1mL于2mL离心管中，加入5μL氨水，涡旋混匀后10000r/min离心5min。

依次用3mL乙腈、3mL20%乙腈水溶液(含1%乙酸)、3mL0.1%氨水溶液活化石墨化碳黑固相萃取柱，500μL提取液上样，700μL超纯水淋洗，最后用1mL75%乙腈水溶液(含0.25%甲酸)洗脱收集于2mL离心管中。洗脱液过0.22μm滤膜于进样小瓶中，4°C下保存，供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 超高效液相色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH Amide(2.1×100mm，1.7μm)；流动相A：水/甲酸/氨水(500:0.075:0.3，v/v/v)，流动相B：乙腈/水/甲酸(700:300:0.1，v/v/v)；梯度洗脱程序：0～2.0min，4%A；2.0～4.0min，4～30%A；4.2～6.0min，30～65%A；6.2～8.0min，65～4%A；柱温40℃；样品温度4℃；进样体积10μL；流速0.4mL/min。

1.3.3 质谱条件

质谱条件：电喷雾离子(ESI)，多反应监测(MRM)，正负离子切换模式；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度600℃；脱溶剂气流量1000L/h；锥孔气流量150L/h。其中STX、NEO、dcSTX、dcNEO采用ESI+，毛细管电压1.0kV，锥孔电压10V；其他目标物采用ESI-，毛细管电压2.7kV；锥孔电压40V；定性、定量离子对及其他参数见表1。

表1 麻痹性贝毒质谱参数

续表1

1.4 毒性转换

STX毒素的毒性因子设为1，其他各种毒素按照毒性因子，统一转换为STXeq来表示，计算公式为：

式中：Xi，各种PSP的含量，μg/kg；ri，毒性因子。麻痹性贝毒毒性因子见表2。

表2 麻痹性贝毒毒性因子

2 结果与分析

2.1 超高效液相色谱-串联质谱法

PSP属于强极性化合物，其中C1与C2、GTX1与GTX4、GTX2与GTX3、dcGTX2与dcGTX3互为同分异构体。本法前处理参考吴海燕等[7]，样品采用1%乙酸水溶液提取、石墨化碳黑固相萃取柱净化；但目标物经氨基柱分离，MRM模式检测。吴海燕采用TSK柱对PSP进行洗脱，保留时间在5.85到6.17min之间；本文利用流动相的酸碱度变化，结合梯度洗脱，可在8min内实现13种PSP的有效分离，保留时间在1.97到4.74min之间，具有可比性。

方法采用空白基质制作标准曲线，13种目标物在4～722ng/mL线性范围内相关系数均大于0.996，检出限为4～14μg/kg。方法回收率为60～105%，日内和日间相对标准偏差(RSD)分别为3～16%和5～17%(n=3)。本方法灵敏度、回收率与精密度良好，适用于各种贝类产品中PSP的检测(表3)。

表3 麻痹性贝毒方法学参数

续表3

2.2 沿海贝类中麻痹性贝毒的监测情况

对沿海六省一市采集的99批次贝类产品进行分析，共检出PSP阳性样品17批次(图1)，分布于浙江、江苏、辽宁三省，其检出率分别为46.67%、35.71%、33.33%。孙烨[8]统计2000～2015年PSP食品中毒事件，发现浙江省中毒案列高于其他各省，与本结果基本相符。

比较采样时间(图2)对PSP检出率的影响，发现6月检出率高达68.75%，7月和9月检出率在18.75%～21.43%间。夏秋两季是赤潮的高发季节，贝类滤食有毒藻类的几率增加，PSP检出率随之增加。本次调查的贝类产品覆盖面广，采集时间较为分散，后期应合理增加采样频次，以便全面评价不同贝类中PSP的安全风险。

图1 各省份贝类产品中麻痹性贝毒的检出情况

图2 各采集时间贝类产品中麻痹性贝毒的检出情况

图3 不同品种贝类产品中麻痹性贝毒的检出情况

由图3可见，6种贝类产品中共有4种贝类产品中有PSP检出，贻贝、泥蚶、毛蚶、扇贝检出率依次降低，分别为38.89%、23.53%、23.08%、16.67%。如表4所示，17批次阳性贝类的PSP含量在66.9～1635.5μg STXeq/kg之间，其中3批次泥蚶的PSP含量超过了联合国卫生组织的安全限值。图4为阳性泥蚶样品和混合标准品中13种PSP的定量MRM色谱图。

表4 阳性贝类样品中的麻痹性贝毒含量

续表4

图4 (A)阳性泥蚶样品和(B)混合标准品中麻痹性贝毒的MRM色谱图

2.2 阳性贝类中麻痹性贝毒的分布情况

PSP中STX毒性最高，其他多种毒素均通过转换成STX当量来表示；NEO的毒力仅次于STX，这两种毒素是PSP监测的重要指标[9]。本次监测发现在13种PSP中STX、GTX5和dcSTX的检出率较高，分别达到82%、71%和71%，而NEO的检出率为41%，与之前文献报道基本一致[9，10]。

通过毒性转化公式将阳性样品中的各毒素统一转换为STXeq，并计算其在总毒素(∑STXeq)中所占的百分比(图5)。从毒素组成分析来看，阳性毛蚶中PSP主要以STX(58～88%)形式存在，还有少量的dcGTX3、GTX5和GTX3(均<5%)；其中2批次样品还含有一定量的dcSTX(11%和36%)。阳性泥蚶中PSP主要以dcSTX(43～75%)、STX(12-22%)为主，此外还含有微量的C1、C2(均<7%)；其中有2批次含有少量GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX3(均<10%)。阳性扇贝中PSP以GTX5(31～38%)、STX(34～38%)为主要存在形式，同时含有微量dcSTX(均<6%)；其中2批次样品中GTX4的含量分别达到21%和25%。

在7批次的阳性贻贝中，PSP存在形式差异较大，其中1批次样品仅含有C1一种毒素；1批次样品含有STX(50%)、GTX1(29%)、NEO(18%)及微量GTX2(3%)；2批次样品特征相似，主要以C2(25%和26%)、dcSTX(24和25%)和NEO(20%和25%)为主，此外还含有微量GTX2、GTX5、dcGTX3、STX(3-9%)；1批次样品主要含NEO(30%)、GTX3(20%)、dcSTX(18%)和dcGTX3(10%)，及微量C1、GTX2、GTX5、STX(2～8%)；1批次样品以NEO(67%)和GTX3(15%)为主，同时有少量C1、GTX2、GTX5(总比<18%)；1批次样品主要以dcGTX3(28%)、C1(25%)、GTX1(23%)、GTX5(19%)形式存在，及少量dcGTX2(5%)。

图5 阳性贝类样品中麻痹性贝毒分布情况

3 结论

采用UPLC-MS/MS方法进行了沿海贝类产品中13种PSP的定性定量分析，本方法灵敏度高、分析速度快、重现性好，可广泛适用于各类贝类产品中麻痹性贝毒的检测。