应用液相色谱-原子荧光联用仪测定富硒大米中的5种硒形态

(杭州市食品药品检验研究院，杭州 310022)

1 引言

硒，作为人体必须要的微量元素之一，它的形态结构及功能越来越受到广大人民的关注。21世纪随着人民生活水平的提高，人们越来越注重养生，各种保健品，营养添加剂，各种辅食都被研发出来满足人民生活需要，但是并不是说补的越多越好，也不是说任何形态的硒都能补[1]。硒元素在能被人体吸收的主要是有机硒，补硒能抗癌，抗氧化，提高免疫力，降低大骨节病与克山病的发病率。硒与人体合成红细胞谷胱甘肽过氧化物酶(RBC GSH-PX)、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHG-PX)、血浆谷胱甘肽过氧化物酶(PGSH-PX) 等都有密不可分的关系。硒还参与甲状腺激素平衡，调控胰岛素介导的代谢作用，磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx,也是一种硒蛋白)受促性腺激素的调节,参与精子的成熟等[2]。自然界中硒主要以无机硒的形式存在，但是无机硒不易吸收，而且人体摄入无机硒是有毒的。有机硒易吸收，但是产量低，价格高，易存在掺假牟取暴利。同时，硒摄入过多会引起硒中毒，导致脱发，掉指甲，无力等症状。因此合理开发利用硒，其重要意义在于保证富硒产品生产过程的安全。存在于食品中硒，有很多种形态，常见的化学形态为硒酸盐(SeVI)、亚硒酸盐(SeIV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、三甲基硒(TMSe)、硒脲(SeUr) 等[3，4]。无法对有机硒的存在形态进行定性以及定量分析的原因在于现行有效的食品安全国家标准测定结果，一般包括测定无机硒在内的硒元素总量。目前，在食品安全国家标准缺乏的情况下，针对富硒农产品的甄别以及食品安全监测的情况，尽快开发更快、更准确地分析农产品中的各种硒形态的检测方法，具有重要意义。

目前，在历年文献中出现有机硒形态检测方法，包括有离子色谱-积分脉冲安培检测法、高效液相色谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP/MS)、液相色谱-原子荧光光谱法及其他联用技术[5-14]，其中HPLC-ICP/MS 仪器设备昂贵、运行成本高,不利于推广应用。高效液相色谱-原子荧光联用或高效液相色谱-质谱联用技术是现在有机硒形态分析的主流方法，由此本实验建立了高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry, HPLC-HGAFS)检测5种硒形态的方法，该方法具有以下优点：原理简单、实验操作快速、结果准确，仪器性价比高，易推广及应用。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

AFS-933/ASP-20原子荧光形态分析仪(北京吉天仪器有限公司)；硒原子荧光空心阴极灯(北京有色金属研究总院) ；AP-9925无油真空泵(天津奥特赛恩斯)；KQ-250E超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Neofuge 15R台式高速离心机(上海力申科学仪器有限公司)。

氢氧化钠(天津市光复科技有限公司)；硼氢化钾(阿拉丁)、磷酸氢二胺(GR 天津市科密欧化学试剂有限公司)；四丁基溴化铵(麦克林)、甲醇(色谱纯J.T.BaKer)、盐酸(GR 永华化学科技(江苏)有限公司)；链霉蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)；脂肪酶(玛雅试剂)、淀粉酶(上海安普科学仪器有限公司)；氨水(AR杭州龙山精细化工有限公司)；甲酸(AR上海凌峰化学试剂有限公司)；97.9μg/g硒代蛋氨酸溶液标准物质GBW 10034、68.9μg/g亚硒酸根溶液标准物质GBW 10032、93.5μg/g硒代胱氨酸溶液标准物质GBW 10087、75.1μg/g硒酸根溶液标准物质GBW 10033(中国计量科学研究院)；Se-甲基硒代-L-半胱氨酸(纯度98% 北京百灵威科技有限公司)；实验用水均为实验室超纯水。

2.2 标准溶液的配置

分别准确吸取1.13mL、1.27mL、1.166mL、1.204mL硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸根、硒酸根于10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得浓度为5mg/L(以硒计)的标准储备溶液。准确称取Se-甲基硒代-L-半胱氨酸23mg于100mL容量瓶中加入1mL盐酸，用超纯水定容至100mL，得100mg/L(以硒计)标准储备液。储存在0～4℃冰箱中。

使用前取不同体积的标准储备溶液置于10mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，混匀，得到一系列标准工作液，浓度分别为10、30、50、100、200μg/L。

2.3 样品处理

取一定量的富硒稻米试样进行粉碎、混匀，过0.850mm孔径筛，称取0.1g(精确至0.001g)富硒稻米样品于10mL离心管中，称取10mg链霉蛋白酶E溶于3mL超纯水，涡旋混匀，置于超声清洗器中，于水温37℃，60min超声提取。待提取结束后，于8000r/min离心20min，吸取上清液，过0.22μm的有机滤膜，然后上机进行检测，同时做样品空白。

2.4 仪器条件

液相色谱条件：色谱柱(C18，5μm，100Å.4.6×150mm，海光仪器)；预柱(C18,5μm，100Å.4.6×10mm，海光仪器)；柱温箱温度30℃；流动相为30mmol/L磷酸氢二铵+0.5mmol/L四丁基溴化铵+2%甲醇，用甲酸调节pH至5.8～6.0；流速为1.0mL/min；进样量为100μL；分析时间为10min。

氢化物发生器条件：载流：10%HCL；还原剂：2%KBH4+0.35%NaOH；氧化剂：0.1%KI+0.35%NaOH；蠕动泵转速为65r/min。

原子荧光检测条件：硒空心阴极灯，灯总电流90mA；辅阴极电流45mA；载气屏蔽气为氩气，流量为300mL/min；屏蔽气流量为600mL/min；光电倍增管负高压为300V，原子化器高度为8mm。

3 结果与分析

3.1 仪器条件优化

3.1.1 流动相的选择

流动相的选择对目标化合物的分离及其重要，根据文献报道，考虑到硒5个形态的分离效果和灵敏度，当用磷酸氢二铵时，适当调节pH，加入四丁基溴化铵与甲醇提高分离度与灵敏度时效果最好。磷酸二氢铵中不加四丁基溴化铵是会使Se-甲基硒代-L-半胱氨酸与亚硒酸根无法分离且灵敏度降低。因此本实验采用的流动相为30mmol/L磷酸氢二铵+0.5mmol/L四丁基溴化铵+2%甲醇。

3.1.2 流动相pH的选择

pH不同时硒形态在水溶液中表现出不同的离子状态，因此流动相的pH对结果影响很大。本研究考察了磷酸氢二铵为流动相时pH4、5、5.5、6、6.5时硒形态的分离效果。结果表明：当pH为4时，亚硒酸根与硒代蛋氨酸重合，且所有峰都有毛刺；当pH为5时，5个峰均已明显分离，但是峰还是有很大的毛刺；当pH为5.5～6时峰均已达到基线分离，且峰均平滑；当pH 越低时，Se-甲基硒代-L-半胱氨酸灵敏度越高，硒酸根灵敏度越低，保留时间越长；当pH为6.5时，硒代胱氨酸灵敏度降低，Se-甲基硒代-L-半胱氨酸与亚硒酸根有部分重合；pH 上升时硒酸根灵敏度上升，亚硒酸根灵敏度上升。因此，综合各方面考虑本研究选择pH6.0作为流动相酸度。

3.1.3 流动相浓度的选择

本实验探讨了20、30、40mmol/L的磷酸氢二铵溶液(pH6.0)对5种硒形态分分离效果的影响。实验结果表明：当磷酸氢二铵溶液(pH6.0)浓度为20mmol/L时，硒酸根保留时间延长，亚硒酸根与硒代蛋氨酸重合；当磷酸氢二铵溶液(pH6.0)浓度为30mmol/L时，可以达到基线分离；当磷酸氢二铵溶液(pH6.0)浓度为40mmol/L时，硒酸根保留时间缩短，但是硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒代蛋氨酸重合。因此本研究采用30mmol/L的磷酸氢二铵作为流动相，此条件下，5种硒形态分离效果最好。

3.1.4 流动相流速的选择

流速对硒形态的分离效果也有很大影响，本研究考察了流速为0.5、0.8、1.0、1.2mL/min的磷酸氢二铵(pH6.0)时分离效果。当流速为0.5mL/min时峰有毛刺、不圆滑。当流速为0.8mL/min时峰也有毛刺。当流速为1.0mL/min时，可以达到基线分离，峰圆滑。当流速为1.2mL/min时出峰时间短但是峰达不到基线分离。因此本实验采用流速为1.0mL/min分离效果最佳。

3.2 提取条件的优化

富硒食品中的硒的存在形态大多以硒代蛋白的形式存在。本实验以SeMet 阳性样品( 通过喷施亚硒酸盐种植出的水稻，即通过生物转化方式实现无机硒向有机硒的转化)由广西大学资源与环境学院提供(总硒含量3.25mg/kg)。因此实验主要优化了链酶蛋白酶E不同提取时间、提取方式对样品中形态的提取效果。通过考察链酶蛋白酶E于37℃超声提取15、30、45、60min，结果表明：当15 min超声提取时，未提取完全；当提取时间设置为45 min 和60 min 时，提取效率均达到较高值，考虑到硒形态特别是硒代胱氨酸稳定性差[15]，本实验选用超声时间为45 min。

3.3 保留时间和检出限

按照材料与方法的操作对5种硒形态系列标准溶液进行测定，实验结果表明：5种硒形态在10～200μg/L范围内的线性相关性较好，检出限在2.27～3.89μg/L之间，结果见表1，标准液相色谱图见图1。

表1 5 种硒形态的保留时间、线性方程、相关系数和检出限

图1 5种硒形态标准溶液色谱图(100 μg /L)

3.4 加标回收实验

选取另一种硒含量不同的富硒大米(总硒测定结果为1.25 mg/kg)作为实验样品, 测此样品各种形态的硒本底值, 再进行加标回收实验, 分别对3 个浓度进行添加回收, 每个浓度6 个平行实验结果表明：5 种硒形态的加标回收率在85.4%～105.5%之间, 相对标准偏差均小于5.8%。结果见表2。

表2 大米中硒形态的加标回收率(n=6)

3.5 样品测定

应用本研究所建立的方法测定了喷施了硒肥的富硒大米试样中的有机硒形态，检测结果发现：在富硒大米中，仅存在硒代蛋氨酸含量(以硒计)一种形态的有机硒。

4 结论

建立了高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry, HPLC-HG-AFS)检测富硒大米中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根等5 种硒形态的方法。样品采用链酶蛋白酶E水解超声提取的方式，30mmol/L磷酸氢二铵+0.5mmol/L四丁基溴化铵+2%甲醇为流动相，用甲酸调节pH至5.8～6.0，经C18(5μm，100Å.4.6×150mm)色谱柱分离后HG-AFS 测定，10min内5种硒形态可以完全分离。各种硒形态标准曲线线性相关系数(r)均大于0.995, 方法检出限为2.27～3.89 μg/L。5种硒形态回收率在85.4%～105.5%之间。实验所建立的方法不仅可以对大米中硒的5 种形态快速、准确地进行定性和定量分析,而且有助于对市场上鱼龙混杂的富硒大米产品进行真伪鉴别和品质甄别，对开展食品安全风险监测、评估具有重要意义。