NLRP3炎性体在炎症性肠炎中作用的研究进展

张海燕，庄云英，曾清芳

炎性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组慢性的可反复发作的非特异性炎症疾病，主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。由于免疫失调所导致的肠黏膜持续炎症，引起屏障功能障碍可能是IBD发病的一个重要原因[1]。因此，了解控制肠道的固有免疫反应调节系统对于明确IBD的发病机制至关重要。NOD样受体(NOD-like receptors, NLR)是一种典型的胞质受体，其家族成员中的NLRP3正迅速成为肠内稳态的关键调节因子。NLRP3作为固有免疫受体，在微生物配体下可介导炎性体复合物的复合组装，引发半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)活化和白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的分泌，而caspase-1和IL-18与IBD的发病密切相关[2]。但目前为止，NLRP3炎性小体在IBD发病机制中的详细作用仍未完全明确。尽管之前有报道称NLRP3炎性小体可诱导IL-1β和IL-18而导致肠道炎症引发IBD。但最近也有报道称IL-1β和IL-18的产生，对肠道起到保护作用。由此可见，IBD炎性体信号传导的具体机制仍值得进一步研究。因此，我们全面回顾近年来关于炎性肠病中NLRP3炎性小体作用的相关文献，讨论了NLRP3炎性小体与肠道黏膜免疫应答、与肠道稳态之间的相互作用，以期为研究者提供参考。

1 NLRP3炎性小体的定义和组成

炎性小体是一组细胞溶质蛋白复合物，能够识别各种应激、外源微生物和内源性危险信号。炎性小体的概念首先由Strowig 在2002年提出[3]，他们发现炎性小体在微生物感染以及黏膜免疫反应和代谢过程调节中可起到关键作用。而炎性小体包括多种亚型，其中NLRP3炎性小体是研究最多也是作用研究最为明确的亚型。NLRP3炎性小体主要由NLRP3、含有半胱天冬酶-1补充结构域(ASC)的凋亡相关接头蛋白和效应蛋白pro-caspase-1。pro-caspase-1广泛存在于粒细胞、抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APC)、巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞上[4]。pro-caspase-1活化后形成caspase-1，进一步可以将IL-1β和IL-18的前体活化成IL-1β和IL-18。此外，caspase-1也被认为参与到细胞焦亡的重要因素之一[6]。可见，NLRP3炎性小体在在炎症反应和疾病的发生中起到重要作用。

2 NLRP3炎症小体的激活和调节机制

机体固有免疫系统是抵御疾病的第一道防线，主要通过宿主模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)识别损伤相关模式分子(DAMPs)或病原体相关分子(PAMPs)来感知微生物或内源性[如Toll样受体(TLR)和NLR]信号。NLR家族成员中的NLRP3在识别PAMP或DAMP中可发挥重要作用。静息细胞中的NLRP3被激活需要两个过程：首先是引发核因子κ-B(NF-κB)激活并转录诱导NLRP3和前-IL-1β；第二步是，来自于微生物或危险信号的信号直接激活炎性小体组件[7]。目前认为的NLRP3炎性小体的激活机制中包括了K+外排，溶酶体组织蛋白酶B泄漏，活性氧(ROS)产生，线粒体功能障碍等多种复杂因素的参与[8]。此外， NLRP3小体在caspase-11和Gasdermin D裂解和孔隙形成的下游也发生了非典型性炎症小体活化[9]。但是，启动信号是否以及如何影响炎症小体的组装和随后的激活尚不清楚，目前Toll样受体参与后诱导的线粒体DNA(MtDNA)进而启动炎症小体激活等相关假设都不能完全解释NLRP3炎症小体的激活过程。因此，更多的研究以阐明其确切机制仍值得研究。

尽管在感染和代谢过程中，NLRP3炎性小体的激活很大程度上有利于宿主的防御，但过量产生的IL-1β和IL-18会导致无菌性炎症而增加患者炎性症疾病风险。在炎性肠病(IBD)的非特异性炎症过程中NLRP3炎性小体的激活和调节也起到了重要作用，相关机制研究也较多，主要包括活性氧参与、黏膜免疫反应、免疫因子、细胞焦亡等多种方面。

2.1 活性氧(ROS)

活性氧是指一类比氧具有更高的化学活性的特殊含氧化合物。在正常情况下，基础水平的ROS具有杀菌作用，参与肠道防御功能。然而，在如IBD等许多慢性炎症的过程中，由浸润的中性粒细胞产生的过量的ROS会触发氧化应激(OS)和蛋白水解酶。而这些蛋白水解酶作用于内皮细胞并引起细胞损伤进而导致肠黏膜屏障受损，腔内病原体的入侵，进而放大炎症细胞浸润和炎症损伤，最终导致肠黏膜坏死、溃疡的发生[10]。此外，积累的ROS可作为传导信使激活细胞内信号通路，如p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB而影响细胞增殖、分化和凋亡[11]。已有研究表明，p38MAPK信号通路的改变是溃疡性结肠炎的一个分子特征，与炎症程度成正比[12]。前期也有Zhong等人研究表明，颗粒刺激可诱导线粒体产生ROS，并通过瞬时受体电位-美司他丁-2(TRPM2)介导钙内流，从而激活NLRP3炎症小体[13]。众多的研究提示，作为黏膜免疫的关键因素的ROS的产生可能是NLRP3炎症小体激活的重要上游事件。

2.2 黏膜免疫反应中

对肠道菌群的异常免疫反应被广泛认为是IBD发生的基础[14]。而在IBD患者的慢性炎症与适应性免疫反应的改变相关，溃疡性结肠炎患者中Th2和克罗恩病患者Th1/Th17相关的黏膜免疫已经被证实参与到了疾病的发展过程中[15]。最近研究提示， IL-1β而非IL-18是肠道中NLRP3炎性小体下游最可能的效应分子，而IL-18可能是通过继发效应间接受NLRP3的影响，因为IL-18缺乏可以也取消了NLRP3在肠道中的保护作用[16]。此外，NLRP3炎性小体通过激活的gasdermin D(Gsdmd)裂解进一步引发细胞焦亡。

2.3 IL-1β

IL-1β主要由固有免疫细胞(如单核细胞，树突状细胞和巨噬细胞)产生，结肠中IL-1β的主要来源是位于固有层的巨噬细胞。在感染，黏膜损伤和应激过程中，IL-1β的激活可通过刺激T细胞增殖引发局部黏膜免疫应答，并通过IL-1β和IL-1R复合物结合使中性粒细胞直接进入损伤或感染部位，并进一步激活NF-κB和MAPK途径，导致其他促炎细胞因子和趋化因子(如IL-6，IL-8和TNF)的上调[17]。同时，IL-1β还可以上调IL-2受体的表达，延长T细胞的存活时间，促进B细胞增殖产生抗体。已经有报道称，在IBD患者和小鼠模型中IL-1β产生过多，提示IL-1β在黏膜炎症过程中的作用[18]。然而，Fan等人的一项研究表明，IL-1β引发的间充质干细胞(MSC)的移植可以减轻化学诱导的结肠炎[19]。因此，关于IL-1β在黏膜免疫应答和IBD中的作用仍然未知，需要进一步研究。

2.4 IL-18

IL-18是一种多功能细胞因子，主要在小鼠和人类的肠上皮细胞中表达，最近的研究结果表明，上皮细胞IL-18的并非依赖NLRP3分泌，而是依赖于caspase-1[20]。但不可忽视的一点是，NLRP3在激活caspase-1中起着重要作用，因此NLRP3也可能有助于肠道中IL-18的产生。IL-18具有诱导干扰素(IFN)-γ和促进Th1应答的功能。既往报道表明IL-18在IBD患者(特别是克罗恩病)中表达上调，并通过上调TNF-α，IL-1和IL-6等促炎细胞因子而发挥作用。但既往研究未能探明IL-18升高具体是IBD的因还是果。最近IL-18基因组位点的多态性被证明是IBD的危险因素[21]。而最近许多研究指出，IL-18对结肠炎和/或结肠炎相关癌症具有保护作用[22]。此外，IL-18可诱导Th1细胞和NK细胞分泌IFN-γ，而IFN-γ可在上皮受损时调节肠道的增殖和修复反应。提示IL-18可能通过维持肠上皮细胞在急性实验性结肠炎中的增殖而参与肠上皮层的修复。此外，IL-18还具有免疫调节功能，如促进Th1细胞增殖和机体对病原体的防御，抑制IgE的产生，并具有抗肿瘤作用[23]。

2.5 IL-1α

NLRP3(NLRP3)炎性小体刺激(如黑热素或尿酸晶体)可诱导IL-1α裂解，使IL-1α和IL-1β的同时分泌。多个细胞表面，特别是单核细胞和B细胞表面的前体IL-1α被称为膜IL-1α。缺乏IL-1α的小鼠表现出炎症减少，不发生细胞死亡和细胞内IL-1α释放[24]。固有IFN-γ活性很大程度上依赖于组成性表达的IL-1α。此外，IL-1α还作为T细胞功能的共刺激物起作用，主要与抗原或促分裂原一起起作用。这些理论提示IL-1α在小鼠模型中可能参与Th2极化。

2.6 细胞焦亡

细胞焦亡是一种特殊形式的程序性炎症细胞破裂，在抗菌固有免疫防御和致死性内毒素血症中起着关键作用[25]。既往研究发现某些病原体激活caspase-1后可促进细胞焦亡，破坏感染的免疫细胞使存活的细菌暴露于循环的吞噬细胞和中性粒细胞中，而阻止病原体的细胞内复制[26]。在TLR2和MDR1A缺陷的自发性结肠炎模型中，共生菌对炎性体的激活导致骨髓CD11b +细胞发生焦亡并可能参与IBD的发病机制[27]。

众所周知，NLRP3炎症小体的激活在肠道黏膜的免疫系统中起重要作用，然而，黏膜免疫功能的紊乱可能导致自身免疫性和炎症性疾病的发生。因此笔者分析认为，在肠道炎症状态的早期阶段NLRP3可能只能参与IL-1β的下游信号转导。但在慢性结肠炎期间，NLRP3也可能有助于IL-18的产生。尽管对IL-18和IL-1β的研究已经发现了一些有趣的结果，但这些细胞因子在IBD中的作用仍需要进一步探讨。此外，包括细胞焦亡在内的具体作用更多研究值得在IBD疾病发生、发展中进一步探讨。

3 NLRP3炎症小体在肠道内稳态与IBD中的作用

胃肠道黏膜内可提供大量的免疫细胞，针对环境中的毒素和潜在的病原体预防感染。越来越多的证据表明，黏膜表面特别是肠内的固有免疫识别是肠内稳态的重要组成。最近的研究进一步强调了NLRP3炎性小体的作用，它不仅是宿主防御的重要介质，而且通过控制肠道上皮细胞的完整性和调节肠道对微生物群的免疫反应，也是肠道内环境稳定的重要调节因子。然而，对NLRP3炎性小体和IBD的研究报道存仍在一定争议。在IBD中NLRP3炎症小体的作用可能有两方面。一方面，炎症小体可增强炎症，导致结肠损伤加重。另一方面，炎症小体又可改善IBS继续进展。因此，需要进一步的研究来确定NLRP3炎症小体在IBD中的确切作用。

3.1 人群研究

最近的全基因组关联研究表明，具有低功能NLRP3表型的多态性与克罗恩病的发生有关，提示NLRP3炎性小体在克罗恩病的发病机制中具有保护作用。以前，NOD2和NLRP3都属于NLRs家族，而NLR蛋白CARD15 / NOD2已经证实与克罗恩病相关[28]。值得注意的是，Villani等人发现NLRP3基因区域中的SNPs rs10733113是克罗恩病易感基因[29]。随后，Schoultz等人也报道了，携带CARD8中的C10X等位基因，NALP3中的Q705K等位基因和NOD2的野生型等位基因的男性表现出对克罗恩病的易感性[30]。此外，最近的研究结果表明，失去功能的CARD8突变也可激活NLRP3炎性小体，并有助于克罗恩病的发生[31]。

最近，NLRP3效应子IL-18的多态性(rs1946518A>C，rs360718A>C，rs202238G>C)被报道与克罗恩病易感性增加有关[32]。然而，一项来自中国的最新研究表明，rs10925019和rs10754558在中国汉族人群中对溃疡性结肠炎的易感性有一定的作用，而对克罗恩并的易感性没有影响[33]。最近的全基因组关联研究分析显示，影响NLRP3下游受体的SNP，如IL18R1，IL1R1，IL1RL1，IL1RL2和IL1R2，与IBD的易感性相关[34]。在最近的病例对照研究中，NLRP3(rs10754558)中的SNP与溃疡性结肠炎相关，rs10754558的“GG”基因型在溃疡性结肠炎患者比健康对照组高2.48倍(P=0.04)，而“CG”基因型在健康人更多见[35]。示NLRP3基因多态性可能导致炎症小体NLRP3基因表达降低，从而影响IBD的遗传易感性。而IL-18在溃疡性结肠炎患者中升高并在促进致病T辅助细胞1反应中发挥作用[36]。而IBD患者结肠组织和巨噬细胞分泌的促炎细胞因子IL-1β表达增加，且与IBD疾病严重程度相关[37]。此外，目前的研究报道了克罗恩病和溃疡性结肠炎在激活NLRP3炎症小体方面存在细微的差异，60%的克罗恩病患者和28.6%的对照组在刺激外周血单个核细胞后激活了NLRP3炎症小体(P=0.042)，而溃疡性结肠炎和对照组之间没有显著差异，而克罗恩病患者的NLRP3炎症小体被激活的比例为28.6%(P=0.042)，克罗恩病和溃疡性结肠炎患者之间的NLRP3炎症小体激活程度无显著差异(P>0.05)。这提示在IBS疾病进展过程中克罗恩病和溃疡性结肠炎的免疫存在一定差异性。

3.2 动物研究

尽管没有模型可以完全模拟人体IBD的所有临床表现和机制，但目前已经建立了各种小鼠实验性结肠炎模型来研究人体IBD的发病机制。葡聚糖硫酸钠模型已被广泛用于研究结肠炎的免疫机制。口服葡聚糖硫酸钠可通过破坏肠道内共生菌的分隔，直接损伤结肠上皮细胞，诱发炎症反应。活化的caspase-1在葡聚糖硫酸钠诱导的炎症中起关键作用，因为caspases-1或NLRP3缺陷小鼠的病理表现明显低于野生型(WT)小鼠，这与IL-1β和IL-18水平的降低有关，表明IL-18的过多产生可加重葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎[38]。

已经证实，化合物MCC950可以显著抑制促炎细胞因子IL-1β，IL-18，和IL-1-α的释放，参与了由典型和非典型NLRP3炎性小体引起的炎症效应[39]。与之相反，最近的一些研究表明NLRP3炎症小体具有维持肠道内环境稳定和保护肠道免受结肠炎的作用，提示NLRP3在肠道炎症中具有保护作用。口服DSS后，NLRP3基因缺陷的小鼠上皮细胞完整性丧失，导致共生菌的全身分散，结肠内大量白细胞浸润，以及更严重的结肠炎，提示NLRP3炎症小体对结肠炎的保护作用是通过促进IL-18的分泌而实现的。注射外源性重组IL-18可部分减轻DSS所致结肠炎的炎症症状。此外，Hirota等人报道，与WT小鼠相比，NLRP3-/-小鼠结肠中保护性抗炎细胞因子IL-10和TGF-b降低，而反映巨噬细胞和中性粒细胞浸润的炎症评分和MPO活性升高，NLRP3基因缺陷小鼠的抗微生物能力也下降，这可能与B-防御素水平降低有关[40]。

此外，一些研究表明，与WT小鼠相比，NLRP3和ASC基因缺陷的小鼠在感染附着/消退的肠道病原体时，细菌的定植和扩散增加，体重下降更明显，肠道炎症加剧。这项研究也提示了，NLRP3在肠上皮细胞中的早期激活可以限制病原体的定植，并防止随后的肠道炎症。而这种保护作用可能与细胞因子IL-1β和IL-18的产生有关。这些发现进一步证实了上皮屏障上的天然免疫识别在保护性免疫启动中的重要作用。综上所述，大部分研究认为，NLRP3炎性小体激活可在肠上皮完整性受损后触发保护反应，并促进受损肠细胞的再生。

4 NLRP3炎性小体和肠道菌群关系

人体肠道中存在超过500种不同种类的细菌，细菌数量高达1014[41]，而这些肠道菌群具有不同的作用，包括代谢，保护和免疫功能。目前认为，肠道菌群失调和改变可能与IBD的发病机制有关。一般来说，溃疡性结肠炎患者的细菌总数高于克罗恩病患者。然而，最近一项研究指出，克罗恩病患者具有更高比例的未分类拟杆菌[42]。最近的研究表明，NLRP3炎症小体在形成肠道微生物群的组成中起着关键的作用。在NLRP3-/-小鼠中也观察到微生物群的数量和组成的改变。Yao等人最近研究，监测获得的功能NLRP3 R258W的小鼠的肠菌群移位情况发现，NLRP3炎性小体和肠道微生物群之间可发生复杂的串扰，并他们还发现，过度活跃的NLRP3炎症小体，导致局部IL-1b的过度分泌，可以通过改造肠道微生物区系，由于调节性T细胞的诱导增加，增强抗炎能力，从而维持肠道内环境稳定，而对IBS具有保护作用[16]。值得注意的是，最近报道肠道菌群可以刺激遗传易感个体产生或保持持续性炎症，这阐明IBD的病因提供了线索[43]。

综上所述，机体免疫反应对于识别和消除危险因素至关重要，而IBD的发生主要与免疫反应失调密切相关。对于IBD发生的机理研究一直是研究的热点。基于人群的研究已经确定了一些与IBD相关的潜在风险多态性。NLRP3调节失调的炎症小体及其在维持肠道健康和黏膜免疫应答中的重要作用已被小鼠结肠炎模型所证实。不可否认，所有的研究都明确表明，NLRP3炎症小体在结肠炎的发病机制中起着关键的作用。此外，肠道菌群组成对IBD模型的疾病严重程度有显著影响。需要指出的是，NLRP3炎症小体在IBD发病机制中的作用尚不清楚，动物实验与人类实验的差异尚待进一步研究。明确NLRP3炎症小体的基本生理和确切机制，无疑将指导今后IBD有效治疗方法的发展。