乙醇熏蒸处理对中华猕猴桃生理代谢及贮藏品质的影响

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(1.大连民族大学生命科学学院,生物技术与资源利用教育部重点实验室,辽宁大连 116600; 2.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

中华猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch),别名藤梨、羊桃等,属于猕猴桃科,猕猴桃属[1]。中华猕猴桃是一种具有较高经济价值的木质藤本植物。猕猴桃果实中含有多种维生素(维生素C等)和丰富的矿物质(包括钙、磷、铁等),还含有胡萝卜素、黄酮等物质,具有较高的营养价值,有“水果之王”、“VC之冠”的美誉。中华猕猴桃作为中国特有的一个品种,其根部具有较高的药用价值,研究表明中华猕猴桃根部提取出的三萜类化合物具有显著的抗肿瘤效果[2],其果实对某些癌症和心血管疾病具有预防的作用[3],具有一定的保健功效。中华猕猴桃不仅口感酸甜,且果肉多汁而鲜嫩,风味极佳,香气宜人,因此成为广大消费者最喜爱的水果之一。中华猕猴桃除鲜食之外,还可以进行加工,如制成复合营养饮料及果醋、特色果酒、果脯、果酱、糖类、罐头等[4-5]。但是由于中华猕猴桃是一种多汁浆果,同时也是典型的呼吸跃变型果实,有明显的生理后熟过程,采后容易变软腐烂,因此研究中华猕猴桃果实采后贮藏保鲜技术极为重要。

乙醇是一种便宜且常见的食品添加剂,已被美国食品和药物管理局列为通用认可的安全物质[6]。乙醇不仅是一种很好的防腐剂,而且还具有延缓植物器官成熟和衰老的功能[7]。相关研究表明,适当浓度外源乙醇处理能够减少果蔬病害以及果蔬衰老;采后西兰花经过乙醇蒸汽处理,抑制叶绿素分解代谢的酶的活性和基因表达,使西兰花延迟变黄[8]。使用乙醇熏蒸处理鲜切茄子,通过减缓茄子呼吸速率、降低酶活性、保持细胞的完整性达到对鲜切茄子的保鲜作用[9]。乙醇还有抑制真菌的作用,将乙醇应用到葡萄保鲜中,通过对灰霉病的防控作用,达到对葡萄的保鲜作用[10]。而乙醇熏蒸处理对猕猴桃生理代谢及品质的影响尚未有报道。本研究通过使用不同浓度的乙醇熏蒸处理,分析其生理代谢及品质的变化,探究最佳的乙醇熏蒸剂量和方法,以期能够为今后的采后猕猴桃贮藏提供一个安全、操作简单且成本相对低廉的新型技术。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

新鲜的中华猕猴桃 采购于大连开发区乐购超市,挑选大小均匀一致、无机械伤害、无病虫害、单果重量在75～85 g的中华猕猴桃,采购当日即入冷库,于(0±1) ℃下贮藏;草酸、2,6-二氯酚靛酚、抗坏血酸、丙酮、碳酸钙、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢、邻苯二酚、愈创木酚、盐酸 均购自天津科密欧化学试剂有限公司。

CR-400型色差计 北京瑞利分析仪器有限公司;TA_XT plus质构仪 北京瑞利分析仪器有限公司;T-25型匀浆机 上海精宏实验设备有限公司;AL240型电子分析天平 日本岛津公司;GC-2010型气相色谱仪 上海精宏实验设备有限公司;UV-2600型紫外分光光度计 上海精宏实验设备有限公司;BR4i台式高速冷冻离心机 日本Hitachi;PAL-1 型数字手持袖珍折射仪 上海精宏实验设备有限公司;DK-S26型电热恒温水浴锅 尤尼柯上海仪器有限公司;UV-2100 型紫外可见分光光度计 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法 将中华猕猴桃分成四组,每组24个,分别放入含有0、250、500、1000 μL/L乙醇的干燥器(4 L)中,置于(0±1) ℃冷库中进行熏蒸处理,熏蒸24 h,通风1 h,再分别将四组中华猕猴桃每四个一组装入密封PE保鲜袋中,(0±1) ℃贮藏。测定猕猴桃第0、14、28、42、 56、70 d中华猕猴桃生理代谢及品质指标。

1.2.2 生理指标的测定

1.2.2.1 硬度测定 使用TA_XT plus质构仪,探头使用P/5探头,根据探头刺入果实后的最大力来测定它的硬度,即第一次刺入时的最大峰值。每次重复测定至少3个果实。

1.2.2.2 呼吸强度测定 参照司琦等[11]的方法,稍作改动,先将经过四种浓度熏蒸处理的中华猕猴桃分别称取200 g放入密封塑料盒中,在0 ℃冷库静置呼吸1 h。然后摇晃塑料盒,使其内部气体分散均匀。接着用GC-2010型气相色谱仪经色谱仪检测后得到色谱图,通过峰面积可得到进样气体CO2的体积分数(%),最后推算出呼吸速率。

1.2.2.3 可溶性固形物(TSS)含量测定 使用PAL-1便携式手持折光仪进行测定,取5 g中华猕猴桃果肉,放入研钵中研磨至磨碎后,经离心(4000 r/min,10 min),取汁液测定。

1.2.2.4 叶绿素含量的测定 参照任红等[12]的方法,称取1.0 g中华猕猴桃果肉样品放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3 mL 80%丙酮溶液,研成匀浆,再加10 mL 80%丙酮溶液继续研磨至组织变白,静置3～5 min提取;然后过滤到50 mL棕色容量瓶中;最后用80%丙酮溶液定容至50 mL,摇匀。注意,各器皿、用具在使用之前必须用80%丙酮溶液润洗。以80%丙酮溶液为空白参比调零,用1 cm光径比色皿在波长663 nm和645 nm处分别比色测定提取液的吸光度值。

叶绿素含量(mg/g)=[(20.29×OD645+8.05×OD663)×6]/(m×1000)

1.2.2.5 果肉颜色饱和度 用CR-400型色差计测定其横切面的色泽,测定方法参照姜爱丽等[13]的方法,每次至少取三个进行测定,取平均值。

1.2.2.6 PPO、POD、CAT 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(peroxidase,POD)的测定方法参照Chen等[14]、Marsellés-Fontanet等[15]的方法,稍作改动形成本实验的测定方法。过氧化氢酶(catalase,CAT)的测定方法参照Cakmak等[16]的方法稍作改动,然后测定其酶活力。分别测定1 min内每克果实在398、460、290 nm处吸光度,结果以U表示,重复3次。

1.2.2.7 总酚、类黄酮含量测定 采用HCl-甲醇法[17],称取2.0 g中华猕猴桃果肉,加入少许经预冷的1% HCl-甲醇溶液,在冰浴条件下研磨,然后转入20 mL刻度试管中。用1% HCl-甲醇溶液漂洗,漂洗后一并转移到试管中,于4 ℃避光条件下提取20 min,收集滤液待用。以1% HCl-甲醇溶液做空白参比调零,取滤液于280、325 nm测定溶液吸光值。以没食子酸为标准品,制作标准曲线,回归方程为y=0.0051x+0.0178(R2=0.995),计算总酚含量。以芦丁为标准品,制作标准曲线,回归方程为y=11.105x-0.0021(R2=0.9998),计算类黄酮含量。

1.2.2.8 抗坏血酸 采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[18]。用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定用草酸提取的果实上清液(摇匀后静置提取10 min,过滤),至出现微红色、且15 s不褪色为止,记下染料的用量,重复三次。

1.3 数据处理

上述实验均需进行三次平行实验,用Excel计算数据的平均值与标准偏差,并用Origin 8做图,SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度乙醇熏蒸处理对中华猕猴桃果实品质的影响

呼吸作用是果蔬采后生命活动的中心,与其品质变化、采后生理变化以及货架期有着较为密切的联系[19]。如图1A所示,对照的呼吸强度呈先上升后下降的趋势,42 d时达到最高峰。而经过乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃的呼吸强度受到明显的抑制,其中250 μL/L乙醇熏蒸处理对中华猕猴桃呼吸作用的抑制程度优于500与1000 μL/L乙醇熏蒸处理,呼吸强度显著低于这两组乙醇处理(P<0.05)。采后果蔬在贮藏前期的新鲜度较好,品质较优,呼吸速率低;贮藏中期呼吸速率开始升高,表明采后果蔬正在逐渐衰老变质;而贮藏后期呼吸速率又下降,表明此时采后果蔬已完全干枯或腐烂,临近衰老死亡状态[20-21]。

图1 乙醇熏蒸处理中华猕猴桃果实对呼吸强度(A)、果实硬度(B)、叶绿素含量(C)、可溶性固形物含量(D)、果肉颜色饱和度(E)的影响Fig.1 Effects of ethanol fumigation treatment on the respiratory rate(A),fruit firmness(B),chlorophyll content(C),TSS(D)and the saturation of flesh color(E)in Chinese kiwi fruit

果实硬度是衡量果实成熟度和贮藏品质的重要指标之一,如图1B所示,在贮藏期间,四种处理条件下果实硬度均呈逐渐下降的趋势,250 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃硬度显著高于同期对照(P<0.05)。500 μL/L乙醇处理的中华猕猴桃果实硬度在第42 d时的果实硬度接近于1000 μL/L乙醇处理的中华猕猴桃。在果实成熟、衰老过程中,果实硬度逐渐降低[22]。实验结果表明乙醇熏蒸处理有利于保持果实硬度,减缓果实的软化速率。

叶绿素是植物进行光合作用的重要色素物质。在水果、蔬菜中也存在着大量的叶绿素。如图1C所示,对照的中华猕猴桃中叶绿素含量呈下降趋势,而经乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃中叶绿素的含量是呈缓慢上升后又下降的趋势,并且250、500与1000 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实中叶绿素含量分解速率差异不显著,在第14～28 d内高于同期对照。Sukanya等[23]对西兰花的研究表明,采后初期,由于有脱镁叶绿素生成,果实中叶绿素值升高,一段时间后,随着果蔬成熟衰老,叶绿素含量不断下降。

如图1D所示,中华猕猴桃果实中可溶性固形物含量在贮藏过程中均呈上升趋势,在第14～42 d,乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃可溶性固形物含量低于同期对照,且在第70 d时,250与500 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实的可溶性固形物含量差异不显著(P>0.05)。随着贮藏时间的延长,果蔬中的淀粉分解转化为可溶性糖,随之可溶性固形物含量也将增加[24-25]。

果肉颜色饱和度的变化是中华猕猴桃品质变化最直观的表现,随着贮藏天数的延长，大多数果蔬的果肉颜色饱和度都会发生一个明显下降的趋势。如图1E所示,四种处理条件下果肉颜色饱和度均呈逐渐下降的趋势,在第42 d,经过500 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果肉颜色高于同期对照,在第56、70 d,乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果肉颜色饱和度差异不显著(P>0.05),但均高于同期对照。

2.2 不同浓度乙醇熏蒸处理对中华猕猴桃果实酶活性的影响

如图2A所示,果实大部分的CAT活性呈现先下降,后升高又下降的趋势。CAT活性高峰总体出现在第56 d,乙醇熏蒸处理后,CAT活性高于同期对照,在第28 d前,250 μL/L乙醇熏蒸处理显著高于其他处理组(P<0.05),在第42、56 d,1000 μL/L乙醇熏蒸处理效果最佳,第70 d,三种乙醇熏蒸处理差异不显著(P>0.05),但均高于同期对照。当果蔬中的活性氧积累过多而不能及时清除时,果蔬的衰老速度将加快。CAT能够催化果蔬体内积累的过氧化氢(H2O2),从而减少H2O2对果蔬带来的氧化损伤[26]。

如图2B所示,在第56 d时PPO活性最高,在第56 d,500 μL/L乙醇处理的中华猕猴桃活性高峰显著低于同期对照(P<0.05),前28 d时PPO活性差异不显著(P>0.05)，乙醇熏蒸处理对PPO活性影响不显著。多酚氧化酶是一种以铜为辅机的酶,PPO将酚类物质氧化成醌类物质,醌类化合物进一步聚合形成褐色、棕色和黑色聚合物,果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关[27]。Rocha等[28]的研究表明,切割后莴苣和苹果的PPO酶活性显著升高,且有明显的褐变现象。

图2 乙醇熏蒸处理中华猕猴桃果实对CAT活性(A)、PPO活性(B)、POD(C)活性的影响Fig.2 Effect of ethanol fumigation treatment on the CAT(A),PPO(B),and POD(C)activity of Chinese kiwi fruit

如图2C所示,在整个实验过程中,中华猕猴桃POD活性呈现先上升后下降的趋势。第14 d时，处理组显著高于同期对照(P<0.05),第70 d时各组果实POD活性没有太大差异(P>0.05)。由此可见,乙醇熏蒸处理不能够降低POD活性。POD是果蔬体内普遍一种重要的氧化还原酶,它与果蔬的许多生理代谢过程密切相关,具有很强的抗性(抗病、抗氧化、抗逆境胁迫等)。POD在有H2O2存在的条件下,POD能够使酚类和黄酮类氧化,再聚合,从而形成褐色物质,导致果蔬褐变[27,29]。Aquino-Bolaos[30]提出PPO和POD有着促进褐变的作用。

2.3 不同浓度乙醇熏蒸处理对中华猕猴桃果实抗氧化物质的影响

如图3A所示,在整个实验过程中,中华猕猴桃果实中维生素C的含量呈下降趋势,经过乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实中维生素C含量显著高于同期对照(P<0.05)。在第14 d时,250与1000 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实维生素C含量显著高于(P<0.05)500 μL/L乙醇熏蒸处理组,在第28 d,三种乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实维生素C含量差异不显著(P>0.05),在第28 d,250 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实维生素C含量显著高于(P<0.01)同期对照。中华猕猴桃中含有丰富的维生素C,VC具有很强的抗氧化能力,所以是重要的抗氧化性物质之一,其抗氧化性与其含量呈正比例[31]，在果蔬衰老过程中起抗氧化剂的作用。

如图3B所示,在整个实验期间,中华猕猴桃果实总酚含量均呈现先上升后下降的趋势,乙醇处理组第28 d达到峰值,500 μL/L乙醇熏蒸处理的效果最显著,在第42 d前,乙醇熏蒸处理中华猕猴桃总酚含量明显高于同期对照。第56 d时乙醇处理的中华猕猴桃总酚含量差异不显著(P>0.05)。实验结果表明,乙醇处理可减缓中华猕猴桃中总酚含量的下降速率。

图3 乙醇熏蒸处理中华猕猴桃果实对抗坏血酸(A)、总酚含量(B)、类黄酮含量(C)的影响Fig.3 Effect of ethanol fumigation treatment on the vitamin content C(A),phenol compounds(B)and flavonoids content(C)in Chinese kiwi fruit

如图3C所示,中华猕猴桃果实中的类黄酮含量呈先上升后下降的趋势,第42 d时达到峰值,乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃果实的类黄酮含量显著高于同期对照(P<0.05),在第42 d前,500 μL/L乙醇熏蒸处理的中华猕猴桃类黄酮含量显著高于同期对照(P<0.05)。第56、70 d的类黄酮含量差异性不显著(P>0.05)。果蔬组织中大量存在着酚类、类黄酮类和花青素等植物次生代谢产物,它们与果蔬的色泽发育、品质和风味形成、成熟衰老过程、组织褐变、抗逆性和抗病性代谢等作用密切相关,对果蔬的贮藏有重要的影响[32]。

2.4 主成分分析

主成分分析法(PCA)是将多个指标转化为几个综合指标的降维统计分析方法[33-34],更利于人们对多个指标进行相关性分析。如图4所示,将11个原始指标综合为三个主成分PC1、PC2和PC3,这三个主成分贡献率分别占数据集总方差的46.343%、22.984%和11.784%(所有数据均进行标准化),累计贡献率达到81.114%。第一主成分与叶绿素含量、果肉颜色饱和度、维生素C含量和果实硬度呈正相关,与可溶性固形物呈负相关;第二主成分与PPO、总酚和黄酮呈正相关;第三主成分与CAT呈正相关。由这些相关性可知,当果实硬度下降,其果实品质也下降,所含营养物质含量下降;PPO活性能够影响总酚和类黄酮的含量;CAT能够催化果蔬体内积累的过氧化氢(H2O2),降低POD与过氧化氢作用,减少因酚类和黄酮类氧化再聚合而形成的褐色物质[35]从而较好地保护了中华猕猴桃果实品质。

图4 主成分分析载荷图Fig.4 Principal component analysis loading map

3 结论

本研究使用不同浓度乙醇熏蒸处理猕猴桃果实,通过相关生理指标的测定与分析,250和500 μL/L乙醇熏蒸处理均能能够较好的抑制呼吸强度,保持果实硬度,减缓VC下降速率;其中500 μL/L乙醇熏蒸处理能够较好的降低PPO、POD的酶活性,较好地保持果肉颜色饱和度、总酚和黄酮的含量;而1000 μL/L乙醇熏蒸处理对猕猴桃果实品质的保持未显示出较明显的作用。综合考虑认为500 μL/L乙醇熏蒸处理为最佳处理组。

以上结果表明,使用适当浓度的乙醇熏蒸处理保持果实固有品质以及酶活性,从而延长果实的贮藏期,同时保证食用的安全性,因而乙醇熏蒸处理在猕猴桃果实保鲜中具有较好的应用前景。但是经过乙醇熏蒸处理对猕猴桃衰老代谢的调控途径、抗氧化代谢途径以及相关代谢基因的调控网络还不清楚,所以仍需要进一步的研究。