长白落叶松3种黄酮化合物定性、定量分析及其抗氧化活性研究

周生学1,邵 莹,郑毅男

(1.吉林农业科技学院中药学院,吉林吉林 132101; 2.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118)

长白落叶松(Larixolgensisvar.koreana)别名黄花松、黄花落叶松、朝鲜落叶松,为高大乔木[1-3]。主要分布于我国黑龙江、辽宁、吉林等地,另外朝鲜和俄罗斯也有少量分布[4]。文献报道,长白落叶松中有许多重要的生物学活性物质[5-6],而自1966年从花旗松树皮中提取出二氢槲皮素(Dihydroquercetin)[7]以来,松树中黄酮成分便成为研究热点问题,而多酚类也成为抗氧化活性的主要成分,捕集和清除氧自由基的能力较强[8-9],具有抗肿瘤[10-12]、抗病毒[13-14]、抗炎抗过敏、抗心血管[15]系统疾病等药理作用[16]。黄酮类成分含有大量的酚羟基,是目前抗氧化剂主要的研究对象。近年来科研人员侧重于对长白落叶松中二氢槲皮素[16-18]提取、分离、纯化工艺进行研究,而对落叶松中含有的其它黄酮类化合物却很少报道[16],只局限于总黄酮的提取[19]和槲皮素及二氢槲皮素活性研究[20]。本研究在探索二氢槲皮素新资源和新工艺的同时,以长白落叶松副产品锯末子[21]为原料,首次对长白落叶松中其他黄酮类化合物进行分离纯化、结构鉴定、含量分析及抗氧化活性测定,以寻找强抗氧化剂的新资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长白落叶松锯末子 2018年从中国吉林省临江市收集获得,由吉林农业大学的郑毅男教授鉴定为30年龄长白落叶松根部干燥粉末;葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 北京瑞达恒辉科技发展有限公司;二氢槲皮素、香橙素、圣草酚 西格玛-奥尔德里奇(上海)有限公司;乙醇、甲酸 分析级,北京化学试剂公司;聚酰胺树脂 广州宝人化学试剂有限公司;2,2-二苯基-1-吡啶酰肼自由基(DPPH)、2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS) 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

SpectraMax iD5酶标仪 美谷分子仪器公司(上海);N-1300D-WB旋转蒸发仪 东京理化(日本);BSA6202S-CW电子天平 赛多利斯(德国);HPLC-MS/MS LCMSD色谱仪 安捷伦(美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 长白落叶松总黄酮的提取、分离和纯化 长白落叶松锯末子(200 g)粉碎,80%甲醇(2000 mL)回流提取2 h,过滤,65 ℃干燥得提取物6.53 g。干燥提取物经葡聚糖凝胶柱分离,乙醇洗脱(2 mL/min)。按时间收集各分离组分,薄层色谱跟踪鉴定,得含有黄酮类化合物组分,浓缩提取物经聚酰胺树脂纯化[22],洗脱条件:水、50%乙醇依次洗脱。薄层色谱展开剂为苯、丙酮和甲醇(8∶3∶0.5),依据分析结果合并洗脱液,浓缩,95 ℃水溶解、过滤,4 ℃冰箱中结晶。得2.3 g总黄酮化合物。

1.2.2 长白落叶松黄酮类物质的定性和定量分析

1.2.2.1 样品预处理 将1.2.1得到的2.3 g黄酮化合物通过制备色谱柱COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×150 mm,5 μm)对样品先进行了部分成分去除和纯化处理,流动相为含有0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇溶液(B),梯度洗脱:0～2 min,35% B;2～12 min,35%～75% B;12～17 min,75%～95% B;17～23 min,95% B;23～25 min,95%～35% B;25～30 min,35% B。流速0.35 mL/min,温度30 ℃,检测波长290 nm,检测时间20 min,进样量20 μL[23]。

1.2.2.2 样品和标准溶液制备 精确称量1.2.1得到的黄酮类提取物样品和二氢槲皮素、香橙素、圣草酚标准品各10 mg,用甲醇∶水(4∶6)溶液定容于10 mL容量瓶中,得到样品和标准品溶液(1 mg/mL),过0.22 μm微孔滤膜。

1.2.2.3 HPLC-MS/MS条件 色谱柱为Phenomenex Lunar(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为含有0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇溶液(B),梯度洗脱:0～5 min,25% B;5～25 min,25%～70% B;25～27 min,70%～95% B;27～33 min,95% B;33～35 min,95%～25% B;35～40 min,25% B。流速0.35 mL/min,温度30 ℃,检测波长290 nm,检测时间30 min,进样量10 μL[23]。

电喷雾离子源(ESI+),离子源温度150 ℃,脱溶温度为200 ℃,毛细管电压2.65 kV,提取器电压5500 V;氮气纯度≥99.99%;脱溶剂气和锥孔气流量分别设定为700 L/h 和50 L/h,质量扫描范围m/z 50～1600。

1.2.2.4 定性和定量方法 外标法测定长白落叶松提取物中的黄酮类化合物含量。由于二氢槲皮素含量高,其吸收峰强度高,影响微量化合物的检测分析。因此对该化合物进行了制备色谱柱分离和部分去除,然后对分离得到的黄酮化合物进行相关的分析,色谱柱为COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×150 mm,5 μm),洗脱条件与1.2.2.3条件相同,计算二氢槲皮素、香橙素、圣草酚含量。

1.2.3 长白落叶松黄酮提取物抗氧化活性测定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力测定 精称128 mg DPPH定容于50 mL无水乙醇,取该溶液10 mL,50 mL无水乙醇稀释,终浓度为1.3×10-4mol/L,取落叶松黄酮提取物、二氢槲皮素、香橙素、圣草酚和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)待测样品(80 μL)与DPPH溶液(80 μL)等体积混合,37 ℃避光反应30 min,517 nm测吸光度(AS),无水乙醇为空白;待测样品(80 μL)与70%乙醇溶液(80 μL)混合,测吸光度(A1);DPPH溶液(80 μL)和70%乙醇(80 μL)测吸光度(A0),根据公式计算清除率,BHT为阳性对照(公式1)[24]。实现50%清除率(scavenging capacity,%)所需的有效浓度记为IC50值。

式(1)

1.2.3.2 ABTS自由基清除能力测定 取86 μL过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)与5 μL ABTS溶液(7 mmol/L)混合,避光、室温放置12～16 h,用70%乙醇稀释,734 nm处测定吸光度为0.70±0.02。待测样品50 μL与200 μL ABTS稀释后溶液混合,734 nm测吸光度(As),ABTS稀释后液体(200 μL)与70%乙醇(50 μL)混合[25],测定其吸光度为A0,根据公式2计算清除率SC。BHT为阳性对照，IC50按前面1.2.3.1所述计算。

式(2)

1.3 数据处理

使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,并使用单因素方差分析验证显著性,P<0.01作为统计学显著性的标准。实验重复3次。

2 结果和讨论

2.1 长白落叶松黄酮类提取物HPLC-MS/MS鉴定结果

经HPLC-MS/MS分析,总提取物HPLC 图(1A)和提取物的离子色谱图(1B),具体信息见表1,长白落叶松提取物中主要含有3个黄酮类化合物,图1A中1、2、3化合物的出峰时间与二氢槲皮素、香橙素、圣草酚标准品出峰时间相同,进一步通过质谱分析,确定这些化合物的结构。

图1 长白落叶松提取物的HPLC-MS/MS谱图Fig.1 HPLC-MS/MS spectra of the L. olgensis var. koreana extract注:A:总提取物HPLC图;B:提取峰的离子色谱图;C～E:化合物1～3的质谱图。

表1 长白落叶松提取物的成分质谱信息Table 1 Composition and mass spectrometry information of extracts of L. olgensis var. koreana

化合物1(图1C)在m/z 305.5284[M+H]+处出现分子离子峰,在m/z 287.0546[M+H-H2O]+、259.0596[M+H-H2O-CO]+、195.0284[M+H-C6H6O2]+和153.0178[M+H-C6H6O2-C2H2O]+处观察到离子碎片,再对比相关文献,与文献[26]报道的二氢槲皮素对应的三个主要离子峰吻合,确定该化合物为二氢槲皮素(C15H13O7,m/z 305.0661[M+H]+;C15H16NO7,m/z 322.0927[M+NH3+H]+;C15H12NaO7,m/z 327.0481[M+Na]+)。

化合物2(图1D)的分子离子峰是m/z 289.0696[M+H]+,同时伴随一个额外的离子峰m/z 271.0597[M+H-H2O]+,离子片段峰为m/z 195.0284[M+H-C6H6O]+和153.0178[M+H-C6H6O-C2H2O]+。其分子量和离子碎片峰与文献[27]吻合,对比后确定该化合物为香橙素(C15H13O6,m/z 289.0707[M+H]+;C15H12NaO6,m/z 311.0526[M+Na]+)。

化合物3与化合物2的分子量相同。化合物3(图1E)的分子离子峰是m/z 289.0678[M+H]+,然而在m/z 271.0596[M+H-H2O]+、163.0385[M+H-C6H6O3]+有两个离子峰碎片,同时还有两个特征峰碎片m/z 179.0335[M+H-C6H6O2]+和153.0178[M+H-C6H6O2-C2H2]+,针对文献报道[27],该两个离子碎片峰为圣草酚的特征峰,由以上数据确定该化合物为圣草酚。

2.2 方法学评价

通过线性、回收率、精密度、重复性、稳定性实验,验证实验的有效性。

2.2.1 线性关系、检出限、定量限 按照1.2.2.2处理,得到质量浓度分别为0.05、0.1、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL基质加标标准工作溶液,按照1.2.2.3色谱和质谱条件进行检测,以标准工作溶液浓度X对定量离子的峰面积Y绘制各化合物标准曲线。实验结果显示,在溶液浓度在0.05～1.00 mg/mL范围内呈现良好线性关系,R2均不低于0.9986,详见表2。信噪比S/N=3计算检出限(LOD)为0.003 mg/kg,S/N=10计算定量限均为0.005 mg/kg。

表2 线性方程和相关系数Table 2 Linear equations and correlation coefficients

2.2.2 回收实验 阴性样品分别添加低、中、高浓度黄酮类化合物标准品溶液(0.8、1.0、1.2 μg/mL),测定3种化合物含量,平行3次,计算回收率。每个水平单独测定6次,结果见表3,二氢槲皮素回收率为98.9%～99.6%,香橙素回收率为99.5%～100.2%,圣草酚为99.4%～99.9%。

表3 加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviation(n=6)

2.2.3 精确度和重复性 通过对3种分析物标准品的3种不同浓度(0.8、1.0、1.2 μg/mL)进行日内测试,进一步验证该方法的精密度。标准偏差(RSD)小于2.11%(表4),表明本实验方法精确度和准确度在可接受范围内。混有标准品的溶液进行日内测试,每天5次,分别测试3 d(相隔天数分别为1、3、5 d)。确定的日内精确度的标准偏差(RSD)为1.29%～1.51%(表4)。结果显示,3个不同日期测试重复性,得出日间测试的标准偏差(RSD)高于其日内偏差,但是考虑分析物浓度为10～100 mg/L,其浓度较低,标准偏差(RSD)处于1.73%～2.90%之间,仍然在可接受的精确度范围之内。

2.2.4 稳定性实验 对二氢槲皮素、香橙素和圣草酚(1 mg/mL)进行稳定性实验。在0、1、4、8、16、24 h注射相同的样品溶液,计算色谱峰面积偏差(RSD),验证黄酮类化合物稳定性。标准偏差(RSD)为1.60%～1.93%(表4),表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

表4 精确度、重复性和稳定性结果(n=6)Table 4 Results of accuracy,repeatability and stability(n=6)

2.3 长白落叶松黄酮化合物含量测定

考虑长白落叶松中二氢槲皮素含量高,峰面积大,影响含量低的化合含量测定,所以对部分二氢槲皮素进行制备和去除,用外标法对长白落叶松中部分去除后分离制备得到的黄酮化合物进行含量测定,标准品的HPLC谱图见图2，得出长白落叶松黄酮提取物中二氢槲皮素含量最多(92.07%),香橙素为2.39%,而圣草酚含量最少,为0.19%,确定长白落叶松中主要含有这3种黄酮类化合物。

图2 长白落叶松提取物、二氢槲皮素、香橙素和圣草酚标准品HPLC谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the L.olgensis var. koreana extraction and taxifolin,aromadendrin and eriodictyol standards注:A:长白落叶松提取物HPLC图;B:二氢槲皮素标准品;C:香橙素标准品;D:圣草酚标准品;峰1、2、3分别为二氢槲皮素、香橙素、圣草酚。

2.4 长白落叶松黄酮提取物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH是最常用的抗氧化活性筛选方法,本实验以清除自由基与DPPH的结合能力评价其抗氧化活性。结果显示(图3),提取物清除自由基的能力高于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT),而二氢槲皮素清除自由基的能力分两个阶段,低浓度(0.001～0.01 mg/mL)时清除率比BHT低,高浓度时(0.05～0.20 mg/mL)清除自由基能力比BHT高,在高浓度(0.2 mg/mL)时落叶松黄酮提取物与二氢槲皮素的清除率分别达到92.21%和93.45%,与BHT差异极显著(P<0.01)。而香橙素和圣草酚清除自由基能力较弱,均低于50%以下,圣草酚的抗氧化能力比香橙素略强。落叶松提取物在低浓度时抗氧化活性高于二氢槲皮素和BHT,高浓度时与二氢槲皮素相似,其原因可能是落叶松中三种黄酮类化合物协同作用,导致低浓度时提取物抗氧化活性较强,而高浓度时主要体现为二氢槲皮素活性。落叶松提取物、二氢槲皮素与BHT对DPPH的IC50值分别为0.0026±0.0004、0.0084±0.0007和0.0247±0.0025 mg/mL。而香橙素和圣草酚IC50分别为0.6315±0.0053和0.3371±0.0036 mg/mL。结果表明,落叶松黄酮提取物和二氢槲皮素均有较强的抗氧化活性。

图3 长白落叶松黄酮提取物、二轻槲皮素、香橙素、圣草酚和BHT清除DPPH的能力Fig.3 Scavenging DPPH free radical ability ofL. olgensis var. koreana flavonoids extract,taxifolin,aromadendrin,eriodictyol standard and BHT

2.4.2 ABTS自由基清除能力 长白落叶松提取物和BHT清除自由基与ABTS结合能力趋势相同(图4),均表现极强的抗氧化能力,而落叶松提取物活性高于BHT,在浓度为0.05 mg/mL时,清除率均达到91.43%以上,二氢槲皮素清除率在0.1 mg/mL时清除率为50.21%,浓度升高到0.2 mg/mL清除率却升高到93.45%,香橙素和圣草酚抗氧化活性一直不是很高,均在50%以下。落叶松提取物、二氢槲皮素和BHT的IC50值分别为0.0083±0.0002、0.0178±0.0004和0.0104±0.0006 mg/mL，香橙素和圣草酚IC50分别为0.6652±0.0034、0.4207±0.0026 mg/mL。表明落叶松黄酮提取物清除ABTS自由基能力强于BHT,在0.2 mg/mL二氢槲皮素表现出较强的抗氧化活性。

图4 长白落叶松黄酮提取物、二轻槲皮素、香橙素、圣草酚和BHT清除ABTS自由基能力Fig.4 Scavenging ABTS free radical ability ofL. olgensis var. koreana flavonoids extract,taxifolin,aromadendrin,eriodictyol standard and BHT

化合物的抗氧化活性与分子结构有关[28],多酚类物质具有抗氧化降血压、抗肿瘤等多种健康功能[29],酚羟基的数量和位置是黄酮类化合物表现抗氧化活性的重要影响因素。随着类黄酮酚羟基数量增加,其抗氧化能力随之增加。同时,邻位酚羟基比间位酚羟基类黄酮抗氧化活性更强,原因是邻位酚羟基容易形成半醌型自由基[30]。二氢槲皮素是长白落叶松中主要化合物,其结构中有五个酚羟基[31],这应该是该提取物的强效抗氧化作用的原因(图5)。

图5 长白落叶松黄酮提取物中黄酮类化合物结构Fig.5 Structures of flavonoids identified in the flavonoids extract of L. olgensis var. koreana

3 结论

结果表明,长白落叶松提取物中含有三种黄酮类化合物,分别为二氢槲皮素(92.07%)、香橙素(2.39%)和圣草酚(0.19%)。在抗氧化活性检测中,长白落叶松黄酮提取物和二氢槲皮素均表现出极强的抗氧化活性,清除DPPH自由基能力二者分别达到92.21%和93.45%(0.2 mg/mL),超过BHT;清除ABTS自由基能力方面,落叶松黄酮提取物表现极强的活性,在浓度为0.05 mg/mL时达到91.43%,二氢槲皮素在浓度为0.2 mg/mL时清除率升高到93.45%。表明长白落叶松黄酮提取物具有较强的抗氧化活性,是天然的强抗氧化剂。